豫西黑猪线粒体COXI基因的扩增和系统发生分析

周武 杨又兵 王阳阳 王丽 徐硕辉 邢沛 和俊豪 卞军平 庞有志

摘要    豫西黑猪作为一个极具发展潜力的地方品种，其种质资源面临着基因混杂的风险。通过对豫西黑猪的线粒体COXI基因进行PCR扩增、测序，并与其他22种不同猪种的COXI基因进行序列比对，采用最大似然法（ML法）和邻接法（NJ法）建立系统发育树，探究其与其他猪种之间的遗传变异及种系发育关系。结果表明，23个猪种该基因序列保守位点和变异位点分别占总位点的96.5%和3.5%，不同猪种间线粒体COXI基因的相似度均在96.5%以上。豫西黑猪线粒体COXI基因表现出明显A、T碱基偏好性。系统发育树和遗传距离结果显示，豫西黑猪种内遗传距离较近，并且与杜洛克猪的遗传距离较近，说明豫西黑猪与杜洛克猪之间存在基因混杂情况。

关键词    豫西黑猪;线粒体;COXI基因;NJ树;ML树

中图分类号    S828.8+9        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）07-0211-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

豫西黑猪是河南西部地区的一个重要且极具发展潜力的特色猪种，具有肉质鲜美、风味独特、抗应激、耐粗饲等优良特性[1]，但由于外来洋猪种的不断引进、实际生产过程中操作不规范、防疫水平低等原因，致使黑猪的优良特性发挥极不充分，濒临灭绝，其保种复壮工作的开展刻不容缓。

线粒体是一种独立且存在于细胞核之外的有双层膜结构的细胞器，其内部拥有不同于细胞核遗传物质的信息量，而且其形态结构较稳定，常被用作分子标记，为生物的遗传、进化、疾病治疗等研究提供了大量分子学依据[2]。COXI基因则是线粒体DNA的重要组成部分，它具有进化速度快、结构稳定、母系遗传等特点，常被作为分子标记来比较生物体种内或种间进化变异的相互关系，现在寄生虫、灵长类动物的分子进化规律及血缘关系的系统发育的研究中大量应用此技术[3]，但目前基于COXI基因对于豫西黑猪的研究还较少。

本研究通过对豫西黑猪的线粒体COXI基因进行PCR扩增、测序，并与其他22个不同猪种的COXI基因进行序列比对，采用MEGA 7.0软件应用邻接法（NJ法）和最大似然法（ML法）建立系统发育树，探究豫西黑猪与其他不同猪种之间的遗传变异关系，以期为豫西黑猪种质资源的保护提供科学有效的理论依据与数据支撑。

1    材料与方法

1.1    试验材料

本研究采集豫西黑猪和商品白猪血液样本各15个，血液样本的采集方法是前腔静脉采血[4]。

1.2    豫西黑猪线粒体DNA COXI基因引物合成

其他猪种的COXI基因序列来自NCBI数据库中Gen Bank，利用Premier 5.0软件对豫西黑猪的COXI基因进行引物设计[5]，上游引物F的序列为5-ACTACTTCCACCATCCT

T-3;下游引物R的序列为5-CCTATAATGGCGAACACT-3，退火温度为48 ℃，引物基因扩增长度为864 bp，该基因的合成工作由上海生工公司完成。

1.3    PCR扩增技术

利用全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，扩增CO-XI基因的DNA片段，PCR反應体系（20 μL）为：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.7 μL，DNA模板1 μL，加入ddH2O至终体积20 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察扩增条带。

1.4    统计分析

将检验合格的PCR产物做好标记及编号，送至上海生工公司进行序列双向测定。将测序结果导入Chromas软件中对测序结果峰值进行人工校对，之后利用DNA MAN 9.0软件对双向测序结果进行拼接，拼接出目的基因COXI基因序列，将序列拼接结果按“fasta”保存于记事本中。从NCBI数据库中寻找其他猪种的COXI基因，按相同“fasta”格式将其保存于记事本中[6]，利用MEGA 7.0软件，将豫西黑猪线粒体COXI基因与其他猪种相应基因进行剪切、比对，分析碱基组成及变异情况，观察豫西黑猪与其他猪种间的遗传距离。

2    结果与分析

2.1    COXI基因序列扩增及测序结果

2.1.1    COXI基因扩增产物结果分析。将电泳产物放在凝胶成像系统及紫外线灯照射下，可以见到1条清晰可见的明亮条带[7]，条带居于长度750～1 000 bp之间且基本处于中间位置，故可基本确定扩增产物的目标长度为864 bp，与预期基本相符。详细扩增产物电泳分析见图1。

2.1.2    COXI基因扩增产物测序结果分析。通过对豫西黑猪的线粒体COXI基因进行测序，结果显示，碱基之间无重叠，结果较为清晰，说明COXI基因扩增、测序结果均符合预期，可以进行后续的序列比对分析。

2.2    豫西黑猪与其他不同猪种的COXI基因序列比对分析

将豫西黑猪线粒体COXI基因双向测序的结果导入DN

AMAN 9.0软件比对拼接，确定13个送检样品的COXI基因序列结果。同时，利用NCBI软件Gene Bank数据库下载的其他28种猪的线粒体COXI基因序列[8]。运用MEGA 7.0软件对比送测的13个豫西黑猪样本的线粒体COXI序列，从中找出具有遗传稳定性的序列3个，并将送测的3个商品白猪中具有遗传稳定性的序列挑出。将选出的豫西黑猪、商品白猪及挑选出的21个其他不同猪种的线粒体COXI基因导入MEGA 7.0软件进行序列比对，将序列两端不准确及序列长度不同的序列进行裁剪，剩下序列长度为832 bp。经过比对，不同猪种间线粒体COXI基因的相似度均在96.5%以上。通过计算得出豫西黑猪线粒体COXI基因各碱基的平均含量比例分别为A 27.4%、T 31.9%、C 24.5%、G 16.2%，A+T的平均含量为59.3%，远高于C+G的平均含量40.7%，表现出A、T碱基偏好性。同时，相较于其他3种碱基，G碱基的含量最少，表现出明显的非G碱基偏好性，这种非G偏爱（Ant

i-Ghias）的特性是后生动物线粒体基因组L-链碱基组成所独有的特点[9]。从序列角度看，12条豫西黑猪线粒体COXI序列中有10条基本相同，而剩余的2条碱基存在一定的差异，从10条不变基因中拿出1条与另外2条相比，存在8个变异位点。该现象说明，豫西黑猪种内COXI基因存在差异性，证明豫西黑猪种间存在变异情况。

2.3    不同猪种间线粒体COXI基因系统发育分析

在数据库中找到民猪、大白猪、杜洛克猪等其他22个不同猪种的线粒体COXI基因序列。将豫西黑猪以及其他22个不同猪种的线粒体COXI基因导入MEGA 7.0软件中，采用邻接法（NJ法）和最大似然法（ML法）基于COXI序列建立系统发育树，其中NJ法是基于遗传距离所建立的方法，不构建聚类，直接为内部节点计算距离，运算速度最快;而最大似然法是基于特征的构建方法，自动检索多次，可信度高[10]。构树成功后，据生成系统发育树的图像显示，此25个不同样本根据遗传距离的远近及亲缘性可以分为3个部分，其中豫西黑猪样本中的1号、5号、16号遗传距离较近，发生聚集;大白、长白、杜洛克等国外商品猪猪种遗传距离较近，发生聚集;而荣昌猪、姜曲海猪等我国地方品种遗传距离相对较近，发生聚集。同时，根据系统发育树的分支情况以及遗传距离显示，豫西黑猪与国内其他猪种的遗传距离大于豫西黑猪与杜洛克等国外商品猪种遗传距离。因此，基本可以证明豫西黑猪样本基因已经发生混杂，故可推测豫西黑猪可能存在与杜洛克国外商品猪杂交等情况。系统发育树构建情况详见图2、3。

3   结论

本文对豫西黑猪线粒体COXI基因进行扩增，扩增长度为864 bp，并对扩增片段进行测序，与其他22个不同猪种进行序列比对及构建系统发育树。结果表明，豫西黑猪与其他猪种的COXI基因具有高度一致性，同时存在大量变异位点，豫西黑猪种内存在变异位点8个，说明豫西黑猪存在种内变异;豫西黑猪与国外商品猪种存在变异位点24个，变异位点多;豫西黑猪与其他地方猪种存在变异位点17个，说明豫西黑猪与其他猪种间存在明显差异，并存在与其他猪种基因混杂的可能。通过利用邻接法和最大似然法建立的系统发育树可知，两树代表的分类意义基本一致，系统发生树基本可分为3支，国外商品猪种遗传距离较近分为一支，豫西黑猪样本分为一支，但豫西黑猪种内存在分支，其他地方猪种分为一支，从系统发生树情况基本得知，豫西黑猪样本与杜洛克等国外商品猪种基因混杂的可能性最大。该试验可为豫西黑猪保种复壮工作提供数据支撑，为豫西黑猪种质基因提纯工作提供了方向，并为其种质资源保护提供科学参考。

4    参考文献

[1] 邢军.养猪与猪病防治[M].北京：中國农业大学出版社，2012.

[2] 伍革民，徐晓风，章熙霞，等.利用微卫星PCR技术分析山猪的遗传结构[J].云南农业大学学报，2008，23（1）：79-83.

[3] 周秀敏，杨永江，任卫合，等.三个国外猪种线粒体COXI基因SNPs筛选及序列分析[J].现代畜牧兽医，2017（8）：23-28.

[4] 李敬瑞，丁远华，张玉龙，等.利用DNA池和测序技术快速筛查SNPs及估算基因频率[J].畜牧与兽医，2011（9）：17-20.

[5] 邱启官，谭磊，商红帅，等.东北虎源蛔虫线粒体基因序列进化分析研究[J].中国预防兽医学报，2017，39（1）：71-73.

[6] 李鑫，陈晓梅，范文颖，等.小鼠隐藏管状线虫线粒COXI基因的扩增及序列分析[J].中国畜牧兽医，2009，36（12）：57-59.

[7] 张顺，廖健，郭昱嵩，等.基于线粒体COXI基因序列的弹涂鱼类系统进化关系[J].广东海洋大学学报，2017（1）：21-27.

[8] 卞军平，杨又兵，娄然，等.豫西黑猪保种场氟烷基因的检测[J].河南科技大学学报（自然科学版），2019（4）：72-75.

[9] 陈建琴，张振华，邢雨辉，等.光滑异装蟹（Heteropanope glabra）线粒体基因组测定及其在系统发生研究中的意义[J].南京师大学报（自然科学版），2018，41（4）：108-114.

[10] 郭静，王超，张宏彬，等.系统发生树构建方法综述[J].计算机应用研究，2013，30（3）：647-655.