奈达铂在微电化学池中的电化学测定研究

赵建松，丁岗芯，贝玉祥，李国达，熊华斌，李晓芬，高云涛

(1.云南民族大学 化学与环境学院，生物基材料绿色制备技术国家地方联合工程研究中心，云南省跨境民族地区生物质资源清洁利用国际联合研究中心，昆明 650500；2.昆明贵研药业有限公司，昆明 650106)

奈达铂(Nedaplatin，NDP)，化学名为顺式-乙醇酸-二氨合铂，是继顺铂、卡铂后第三代铂类抗肿瘤药物。主要用于食管癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌的治疗，是我国和亚洲应用广泛的抗肿瘤药[1-5]。其疗效与顺铂相当或更优，具有治疗指数高、肾和胃肠道毒性低、使用方便、不需水化等优点[6-8]。目前文献报道的NDP 分析方法仅见高效液相色谱法一种[9-13]。电化学方法具有响应迅速、低成本、灵敏度高等优势，能够帮助研究者更好地完成对铂族药物进行原位、在线、实时、动态等复杂的分析任务，获得更多的生理生化信息[14-17]。已有研究表明铂族抗癌药物具有良好的电化学响应，并据此建立了卡铂[18]、顺铂[19]、甲啶铂[20]等的电化学测定方法。

随着新材料、新器件和新方法在电极和传感器系统中的发展，电化学分析在药物质量控制、代谢研究、作用机理和毒害物质分析等领域获得广泛应用[21]。丝网印刷电极(Screen Printed Electrode)具有结构小巧、集成度高、成本低、可批量生产等特点，因其前处理简单，使用方便，在药物、代谢产物和降解物分析中的应用受到广泛关注[22-30]。近年来，研究者致力于应用丝网印刷电极构建小型化、便携式的在线微量分析系统，可应用于实现多种介质中微小量样品(20～100 µL)的快速分析，展现了良好的应用前景[31-34]。

本文基于丝网印刷电极的特点设计和制作了一种新型的微电化学池装置，研究了NDP 在微电化学池中的电化学行为，建立了NDP 的电化学微量快速测定新方法，并将其应用于NDP 生产线样品的在线快速电化学分析，为铂族药物分析提供了一种新的思路。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI650E 型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；DRP-110 丝网印刷电极(瑞士万通有限公司)，电极为陶瓷基底，工作电极和对电极为碳浆、参比电极为银/氯化银浆印制，三电极呈直径为7 mm 的圆形区域；丝网印刷电极连接线；1.5 mL 圆底聚丙烯离心试管；紫外光胶(配备紫外灯)。

NDP 标准品(白色粉末状，含量≥99.0 %，昆明贵研药业有限公司)，用pH=7.4 的0.1 mol/L 氯化铵溶液溶解，配制为1 mg/mL 的贮备液，于4℃避光密封保存，使用前用0.1 mol/L 的氯化铵溶液稀释为一定浓度的标准溶液。NDP针剂(固体，规格：10 mg，江苏奥赛康药业有限公司)。NDP 生产线初产品(白色晶体，昆明贵研药业有限公司)。氯化铵、醋酸钠、冰乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氢氧化钠、铁氰化钾、亚铁氰化钾等均为优级纯(GR)试剂，纯度(质量分数)≥99.8%。实验用水为去离子水。

1.2 丝网印刷电极基微电化学池制备

本文设计的丝网印刷电极基微电化学池装置包括丝网印刷电极基片和半圆状槽体两部分，装置如图1 所示。丝网印刷电极采用瑞士万通有限公司市售的DRP-110 丝网印刷电极，具有尺寸合适圆形三电极区。半圆状槽体采用1.5 mL 圆底聚丙烯离心试管沿中线垂切开制得，其圆形部分略大于丝网印刷电极三电极区。将半圆状槽体切面圆形部分正对于丝网印刷电极的圆形三电极区，外缘与电极基片用紫外光胶粘合，即可制得一半圆柱状体的丝网印刷电极基微电化学池装置。本法所制备的微电化学池相对于微流控芯片、纸基微电极等已有的丝网印刷电极基电化学池装置而言，具有制作简单快速，材料易得，成本低廉，可抛弃式使用等优点。

图1 微电化学池构建图Fig.1 Miniature electrochemical reaction cell construction diagram

1.3 电极活化

使用微量进样器准确移取100 µL 0.05 mol/L 氢氧化钠溶液于微电化学池中，在电位范围-0.8～1.0 V、扫描速度0.05 V/s、扫描段数2、采样间隔0.001 V 的条件下循环伏安法扫描30 次，用去离子水洗净，风干备用。

1.4 电化学测定

微电化学池竖直固定，将其用丝网印刷电极连接线与电化学工作站相连接，使用微量进样器准确移取100 µL 待测试溶液于微电化学池中，进行循环伏安(CV)和差分脉冲伏安(DPV)测定。其中，CV 测定参数为：电位范围-0.8～1.0 V、扫描速度0.05 V/s；DPV 测定参数为：电位范围-0.2～1.2 V、脉冲宽度0.04 V、电位增量0.005 V、振幅0.05 V、脉冲周期0.9 s。

2 结果与讨论

2.1 微电化学池性能分析

用电化学工作站进行测定时，当微电化学池溶液体积达到0.1 mL，即可完全覆盖三电极区域。以0.05 mol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1:1)，0.1 mol/L KCl 作为电化学探针溶液，在微电化学池上进行电化学性能测试，并使用常规电化学池(相同电极，溶液量20 mL)进行对比测试，结果如图2 所示，得到的分析性能参数列于表1。

图2 微电化学池和常规电化学池的循环伏安图和差分脉冲伏安曲线Fig.2 The CV curves (a) and DPV curves (b) of miniature electrochemical reaction cell and conventional electrochemical cell

表1 分析性能测定结果(n=5)Tab.1 Analytical performance measurement results (n=5)

从图2 中可以看出，微电化学池对探针溶液较常规电化学池具有更好的电化学响应，并在一定程度上改善了对探针溶液CV 和DPV 的测试性能。根据表1 所示结果，与常规电化学池相比，微电化学池的氧化峰电位(Epa)与还原峰电位(Epc)之比变小，氧化峰电流(Ipa)与还原峰电流(Ipc)之比更接近1，说明微电化学池中的电化学反应可逆性更好；从DPV测定结果看，Ipa值较常规电化学池明显增加，更重要的是，微电化学池的测试相对标准偏差(RSD)值比常规电化学池更低，表明相同条件下微电化学池具有更高的测试精密度。

2.2 支持电解质及其酸度的影响

条件试验中以醋酸-醋酸钠溶液、PBS 缓冲溶液、氯化钾溶液和氯化铵溶液作为支持电解质进行对比测定。结果表明：NDP 在0.1 mol/L 的氯化铵溶液中呈现出一对明显的氧化还原峰，峰形较好，且峰电流值与其浓度呈正比关系。选择0.1 mol/L的氯化铵溶液作为支持电解质。

进一步探究了pH 值对NDP 电化学行为的影响。pH 值在5.5～8.5 范围内，Epa和Epc均随pH 值的增加而逐渐负移，说明在该pH 范围内NDP 在微电化学池中的电化学行为受H+质子的影响较大。Ipa值随pH 值的增加而呈现先增加后减小的趋势，在pH=7.4 左右达到最大值，且峰形最好。因此，最佳pH 值为7.4。

在优化条件下对NDP 进行CV 测定，结果如图3 所示。由图3 可见，向空白底液(0.1 mol/L 氯化铵溶液，pH=7.40，虚线)加入NDP 溶液后，出现一对明显的准可逆氧化还原峰(实线)，Epa和Epc分别为0.61 V 和0.02 V，氧化还原峰电位差(∆E)为0.57 V，Ipa与Ipc的比值为2.03。

图3 奈达铂在微电化学池中的循环伏安图Fig.3 The CV curves of nedaplatin in miniature electrochemical reaction cell

2.3 扫描速度的影响

在微电化学池中加入100 µL 一定浓度的NDP标准溶液，探究了扫描速度(v)在0.01～0.1 V/s 范围内对NDP 电化学行为的影响，结果如图4 所示。

图4 奈达铂在不同扫速下的循环伏安图Fig.4 The CV curves of nedaplatin at different scan rate

由图4 可见，Ipa和Ipc随着v的增加而均匀增加，Epa正移，Epc负移，且Ipa与Ipc均与v的平方根成正比，其线性关系分别为：

上述结果表明，在0.01～0.1 V/s 的扫速范围内，NDP 在微电化学池电极表面的氧化和还原过程是准可逆过程，在此范围内受扩散控制。大量重复性实验表明，当扫速在0.05 V/s 时，CV 测定的峰形最佳，重现性好，因此本实验选择的扫速为0.05 V/s。NDP 的峰电流(Ip)与v成线性关系，根据Laviron 理论，有如下关系式：

式中，n为电子转移数，F 为法拉第常数，A为电极表面积，T为298 K，R 为摩尔气体常量，Q=nFAT为循环伏安单一过程的峰面积(以电量计)。由上式可知，在一定扫数下，通过计算NDP 的峰面积，可得出参与电子反应的电子数。因此当v=0.05 V/s时，不同浓度NDP 参与电极反应的电子数约等于2。

2.4 分析性能及干扰试验

按照1.4 操作，用微电化学池对NDP 进行DPV定量分析，测定了不同浓度的NDP 在微电化学池中的氧化峰，结果如图5 所示。

图5 不同浓度奈达铂的差分脉冲曲线图Fig.5 The DPV curves of nedaplatin at different concentrations

根据图5 数据，NDP 的Ipa值与其浓度(c)在0.4×10-2～1.2×10-2mg/mL 范围内呈现良好的线性关系，线性方程为Ipa=-284.57c+0.0329 (R2=0.9995)，检出限(3s/b)为3.97×10-4mg/mL。

干扰试验表明，当干扰水平为5%时，3 倍的Pt(II)，100 倍的K+、Na+、Ca+、Mg2+和NO3-、SO42-、Cl-，10 倍的Fe3+、Co2+和Ni2+，20 倍Cu2+、Pb2+和Cd2+不干扰测定结果。

2.5 样品测定

模拟注射液使用江苏奥赛康药业有限公司生产的注射剂固体，按照临床注射使用方法，用生理盐水配制为0.80×10-2mg/mL 的模拟注射液。生产线样品取自昆明贵研药业有限公司NDP 合成生产线待包装的晶体，用生理盐水溶解配制为0.80×10-2mg/mL生产线样品测试溶液。两种样品测定前用0.1 mol/L 氯化铵溶液(pH=7.4)稀释至一定浓度，根据1.4 项所述方法进行DPV 的测定，进行加标回收实验，并与液相色谱方法进行对照，结果如表2 所列。

表2 实际样品加标回收实验测定结果(n=5)Tab.2 Measurement result of actual samples by recovery experiment (n=5)

根据表2 的结果，测得模拟注射液和生产线样品的RSD在1.38%～2.18%之间，加标回收率在97.4%～ 103.8%范围之间，表明本方法具有良好的准确度和精密度。样品浓度的测定平均值与液相色谱法的结果相近，因此本法可以用于生产、临床使用等过程中NDP 的定量快速在线测定。

3 结论

1) 用市售丝网印刷电极和圆底聚丙烯离心试管制作得到微电化学池。该微电化学池试液容量为0.1 mL，制作简便，材料易得，成本低廉。

2) 研究了抗癌药奈达铂(NDP)在微电化学池中的电化学特性，考察酸度、支持电解质和扫描速率对循环脉冲和差分脉冲曲线的影响，结果表明微电化学池对探针溶液较常规电化学池具有更好的电化学响应。

3) 采用差分脉冲方法进行NDP 的定量测定。NDP 浓度0.4×10-2～1.2×10-2mg/mL 范围内，与Ipa值内呈现良好的线性关系，测定结果与液相色谱法测定结果相当。

4) 这一技术可用于企业生产、临床用药等过程中NDP 的定量快速测定，亦可用于其它铂类药物生产和使用过程中的快速在线分析，并有望拓展到环境、生物等领域的贵金属及稀有金属的微量快速测定。