不同类型腐乳中挥发性风味成分比较分析

胡文康，孙莉，王嘉瑞，李青卓，汪超，徐宁

(湖北工业大学 生物工程与食品学院 湖北省食品发酵工程技术研究中心，武汉 430068)

腐乳又称豆腐乳，是一种发源于我国的传统发酵食品。腐乳是豆腐经多种微生物发酵后，加入黄酒、胡椒、茴香等不同香料后混合制成[1]，其富含氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素等[2-4]，具有降血压、降血脂、抗氧化的功能[5，6]，是不可多得的餐桌美食。腐乳广泛地分布于全国各地，由于各地的气候物产、风俗习惯、饮食爱好存在着较大差异，各地的腐乳也有独特的风味[7]，通常根据其不同的风味分为青方、红方、白方三大类。腐乳各自独特的风味成分是由豆腐胚中植物蛋白质、碳水化合物等在不同微生物的作用下分解成风味多肽、氨基酸及脂肪酸等风味前体物质[8]，再经过后酵产生的[9]。

目前，国内外对腐乳的风味研究主要集中在单一类型腐乳方面，刘娜等[10]使用GC-MS和气相色谱-嗅闻仪(GC-O)对红方腐乳进行风味分析；马艳莉等[11]使用动态顶空稀释法(DHDA)与GC-MS联用测定了青方腐乳的风味物质；蒋丽婷等[12]使用HS-SPME与GC-MS联用的方法测定了白方腐乳中的挥发性风味成分，但是不同种类腐乳之间的区别还鲜有报道。

本文以青方、红方、白方腐乳为研究对象，采用同时蒸馏萃取和HS-SPME与GC-MS联用技术分析其挥发性成分的种类及含量，探索不同类型腐乳风味成分的差异及特点，为腐乳间风味物质的研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腐乳：购于超市；王致和臭豆腐(青方)、王致和大块腐乳(红方)、王致和精致白腐乳(白方)：北京二商王致和食品有限公司；氯化钠、二氯甲烷、无水硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司。

Agilent GC-MS 7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；SPME手动进样手柄及萃取头(CAR/PDMS) 美国Supelco公司；HH-8CJ数显磁力搅拌恒温水浴锅 常州市金坛友联仪器研究所；氮气吹扫仪 常州朗越仪器制造有限公司。

1.2 腐乳挥发性风味物质检测方法

1.2.1 同时蒸馏萃取法(SDE)

1.2.1.1 萃取方法

取30 g腐乳固形物，捣碎，与150 mL 去离子水充分混匀后加入到SDE装置水相一侧500 mL圆底烧瓶中，在SDE装置有机相一侧100 mL圆底烧瓶中加入50 mL二氯甲烷，用电热套加热水相烧瓶，使其中溶液保持沸腾；有机相烧瓶于40 ℃恒温水浴，整个提取过程持续2 h，收集萃取液，置于-20 ℃冰箱冷藏24 h后，使用无水硫酸钠过滤除水。再经韦氏分馏柱蒸馏和氮吹浓缩至1 mL，0.22 μm有机膜过滤后，加入100 μL 0.381 mg/mL 2-辛醇的二氯甲烷溶液作为内标物，进行GC-MS 检测。

1.2.1.2 GC-MS检测条件

色谱柱：Agilent HP-5MS(30 cm×250 mm×0.25 μm)；程序升温：初温50 ℃，保持1 min， 以3 ℃/min的速率升温到185 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率升温到250 ℃，保持8 min；溶剂延迟5 min。

电离方式：EI；电子能量：70 eV；扫描质量：35～400 amu。

1.2.2 顶空固相微萃法(HS-SPME)

1.2.2.1 萃取方法

取5.0 g 腐乳固形物，捣碎，与100 μL 0.381 mg/mL 2-辛醇的水溶液、1 g 氯化钠、5 mL 去离子水混合于顶空瓶中，然后于60 ℃磁力搅拌水浴锅中30 min，萃取30 min，进样。

1.2.2.2 GC-MS检测条件

色谱柱：Agilent HP-5MS(30 cm×250 mm×0.25 μm)；程序升温：初温50 ℃，保持1 min，以15 ℃/min的速率升温到185 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min的速率升温到250 ℃，保持1min；进样口温度250 ℃，解吸3 min。

电离方式：EI；电子能量：70 eV；扫描质量：35～400 amu。

1.3 数据处理

通过Agilent GC-MS处理软件处理原始数据，使用NIST 14数据库检索定性，使用内标法计算各物质含量，通过Simca-P软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 腐乳中共有挥发性物质

表1 SDE法检测的挥发性成分及其组分含量Table 1 The volatile components and their content detected by SDE method

续 表

续 表

由表1可知，3种腐乳通过SDE-GC-MS法测定出挥发性物质共114种，红方腐乳检出物质53种，其中酯类物质19种，杂环类物质5种，烯类物质3种，酮类物质2种，烃类物质2种，酸类物质6种，醛类物质6种，酚类物质3种，醇类物质4种，其他类3种，未检出芳香类物质；白方腐乳检出物质50种，其中酯类物质16种，杂环类物质3种，烯类物质6种，酮类物质2种，烃类物质1种，酸类物质3种，醛类物质4种，酚类物质3种，醚类物质1种，芳香类物质1种，醇类物质5种，其他类2种；青方腐乳检出物质44种，其中酯类物质13种，杂环物质2种，烯类物质1种，酮类物质1种，烃类物质6种，酸类物质7种，醛类物质1种，醚类物质2种，酚类物质2种，芳香类物质1种，醇类物质4种，其他种类4种。

图1 SDE法提取不同种类腐乳物质的含量Fig.1 The content of volatile components from different kinds of sufu extracted by SDE

由图1可知，3种腐乳中酯类物质含量均很高，白方腐乳中的醇类物质含量最高，青方中酚类物质含量最高，并且含有其他两种腐乳中没有的含硫类化合物和胺类化合物。

表2 HS-SPME法检测的挥发性成分及其组分含量Table 2 The volatile components and their content detected by HS-SPME method

续 表

续 表

由表2可知，通过HS-SPME-GC-MS法测定，一共检出挥发性物质102种，红方腐乳检出物质52种，其中酯类物质17种，酮类物质3种，醛类物质3种，酚类物质6种，醇类物质4种，其他类18种；白方腐乳检出物质45种，其中酯类物质10种，酮类物质1种，醛类物质3种，酚类物质6种，醇类物质5种，其他类20种；青方腐乳检出物质40种，其中酯类物质10种，酮类物质1种，醛类物质1种，酚类物质6种，醇类物质6种，其他类16种。

图2 HS-SPME法提取不同种类腐乳物质的含量Fig.2 The content of volatile components from different kinds of sufu extracted by HS-SPME

由图2可知，红方腐乳与青方腐乳的酯类物质含量较高，白方腐乳的醇类物质含量最高，青方腐乳的酚类和杂环类物质含量最高。

根据3种腐乳所鉴定出的挥发性物质绘制韦恩图(见图3)，发现不同腐乳之间区别较大，在3种腐乳中均被鉴定出的物质仅有14种，分别是苯酚、对乙基苯酚、苯乙醇、桉叶油醇、二叔十二烷基二硫化物、植烷、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、硬脂酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕榈酸、苯乙醇、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸。

图3 不同种类腐乳中物质韦恩图Fig.3 The Venn plot of substances from different kinds of sufu

在腐乳中，烃类物质的产生可能是由于脂肪的分解。但烃类物质风味阈值较高，香气特征并不明显，故对各类腐乳风味的贡献不大[13]。烯类物质检出12种，但并没有检测出3种腐乳共有的物质。酯类物质是在腐乳前期发酵过程中，醇和脂肪酸通过酯化反应所生成的，能够赋予腐乳花香、果香或者蜂蜜味[14]。在3种腐乳中的共同检测出的酯类物质主要有亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、硬脂酸乙酯以及2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯等。酯类物质气味浓郁，香气持久，两种方法所检出的酯类化合物相对占比均较多，共同构成腐乳香气的主体部分。在3种腐乳中共检测出16种醇类化合物，如乙醇、苯乙醇、4-萜烯醇、柏木脑、桉叶油醇、苯甲醇、芳樟醇等。在发酵过程中，杂菌的影响会使腐乳产生不良气味，而醇类物质能够将其掩盖；苯甲醇能够产生樱桃味道，其他几种醇类物质赋予腐乳坚果味、果香等[15]。醛类化合物通过Strecker反应和腐乳中亚油酸等物质氧化反应产生，该类香气浓烈，可能对腐乳的风味产生重要作用[16]。在3种腐乳中共检测出12种醛类物质，其中苯甲醛具有樱桃或杏仁气味，苯乙醛具有面包香和玫瑰气味，其他醛类物质赋予腐乳甜味、水果味等芳香特质。酮类化合物是在霉菌酶系的作用下氧化或降解脂质的产物。这类物质性质稳定、有着良好的气味。在3种腐乳中共检测出8种酮类化合物，其中甲基环戊烯醇酮能够赋予腐乳甘草气味。吡嗪类物质具有坚果香。呋喃类物质具有焦香。

2.2 腐乳中特有风味物质

2.2.1 青方腐乳中特有的风味物质

青方腐乳中含量较高的挥发性物质有吲哚、苯酚、丁酸丁酯、亚油酸乙酯、丁酸丙酯、2,4-二叔丁基苯酚、油酸乙酯、棕榈酸乙酯、苯乙醇、桉叶油醇等。

青方腐乳是3种腐乳中风味最为独特的一种，其“闻着臭吃着香”的特点使其收获了大批喜好者。根据气质定性结果来看，青方腐乳含有高浓度吲哚和含硫类化合物，这与马艳莉等的研究报道一致。吲哚在极低浓度时具有茉莉花香，而当浓度上升后，则会呈现出接近于人类排泄物的味道，此外，青方腐乳检出了二甲基三硫、二叔十二烷基二硫化物等多种含硫类化合物，这些化合物产生臭鸡蛋的气味，这些可能是青方腐乳具有独特风味的主要原因。青方腐乳含有多种酸类物质，如丁酸、辛酸等，少量的丁酸具有水果香气，而过量的丁酸则被报道具有“汗状、酸味、刺激性气味”[17]，这可能也是构成青方腐乳独特风味的原因之一。

青方腐乳样品中的酯类物质总含量与其他两种腐乳相比相差不大，特有的丙酸丁酯具有独特的苹果香气，这在马艳莉等[18]的报道中也有提及，但是由于过多的臭味物质的存在，这些味道被掩盖，难以被察觉。此外，青方腐乳含有着高浓度的酚类物质，这些物质能够赋予腐乳木香、药香、辛香、丁香等香气特征[19]。但是是否较高浓度的酚类物质也会产生独特风味参与青方气味的构成，尚无文献报道。

2.2.2 白方腐乳中风味物质

白方腐乳中含量较高的挥发性物质有茴香脑、辛酸乙酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、苯乙醇、亚油酸、丁酸丁酯、间二甲苯、二甲基三硫、苯酚等。

白方腐乳具有含量较高的酯类与醇类物质。酯类化合物是构成腐乳风味最基本也是最主要的物质，由于不含有刺激性极大的风味物质(如青方腐乳中的吲哚)或制作过程中人工添加其他调味料(如红方腐乳中的红曲等)，白方腐乳能够最大程度地展现豆腐发酵后的真实风味，所以白方腐乳样品中所检测出的酯类物质在其他2种腐乳中均有检出，却能够更加明显地呈现出由酯类物质所赋予的风味特征。

白方腐乳样品中检测出了以下醇类物质：茴香脑，含量较高，具有茴香味和甜味；芳樟醇，具有百合花香气[20]；松油醇，具有紫丁香的香气。这些醇类物质赋予了白方腐乳温和、纯正的香气，这与Liu等的研究报道一致[21]。在白方腐乳中，同样也检测出了含硫类化合物的存在，但是并没有明显的令人不适的味道出现，这可能是由于醇类物质含量较多，能够将不良气味掩盖。

此外，在白方腐乳中检测出了两种烯类物质，石竹烯具有辛香、木香、柑橘香、樟脑香、温和的丁香香气；柠檬烯具有柠檬香气[22]。

2.2.3 红方腐乳中特有风味物质

发酵腐乳过程中加入红曲和其他香料，便可制得红方腐乳，颜色鲜亮，气味较青方腐乳更加令人接受。红方腐乳样品中所检测出的醇类物质是3种腐乳中含量最少的，与以往报道有所出入。这可能是由于本次实验均为提取腐乳固形物，而红方腐乳人工添加的香料多存在腐乳汁中，故本次实验结果出现这种状况。

红方腐乳中含量较高的挥发性物质有硬脂酸乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、3'-甲氧基苯乙酮、丁香酚、十四酸乙酯、十五酸乙酯、辛酸乙酯、乙醇、棕榈酸乙酯、2,4,6-三羟基苯甲醛、α-石竹烯等。

红方腐乳样品中酯类物质种类较多，只在红方腐乳中检测出的酯类物质有苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、烟酸乙酯等，其中苯乙酸乙酯具有蜂蜜味香气，乙酸苯乙酯具有甜蜜香气，壬酸乙酯具有水果、白兰地香气，3-羟基丁酸乙酯具有葡萄香和白酒似香气，这些酯类物质的阈值较低，对红腐乳的香气贡献较大[23]。

红方腐乳样品中酮类与醛类物质含量是三种样品中最高的。酮类物质能够赋予红方腐乳甜香，其中2-壬酮还能赋予红方腐乳水果药草香气；醛类物质阈值低，呈香能力强，3-甲硫基丙醛具有典型的酱香、咸香，壬醛具有橙香，2-苯基巴豆醛则呈可可和红茶似香气。红方腐乳中还含有的β-石竹烯，具有丁香味。

2.3 统计学研究腐乳特征香气物质

将多次实验的原始数据转换格式后通过Simca-P进行统计学分析。基于3组腐乳GC-MS结果所绘制的PCA图见图4，其中white组代表白方腐乳样本，cyan组代表青方腐乳样本，red组代表红方腐乳样本。该模型R2X=0.905，拟合能力强；Q2=0.611>0.5，预测能力强，该模型可靠。图中每个点代表了组中的一个单独样本，非监督的PCA得分图反映了样本的集中趋势，可以看出3组样本已经有明显的分离趋势，说明3组样本之间存在着显著差异，同时样本内部的一致性较好。

图4 3种腐乳PCA分析图Fig.4 PCA plot of three kinds of sufu

在此基础上将3组样品两两进行OPLS-DA分析，见图5。

图5 3种腐乳OPLS-DA分析图Fig.5 OPLS-DA plots of three kinds of sufu

OPLS-DA分析可以根据样本数据，将不同物质按照其构成组间差异的能力进行评估，即VIP值，VIP值越大，说明该物质越能使两组样本产生差异。选择VIP值大于1的物质，并在此基础上从中选出P值小于0.01的物质，最后筛选出白方腐乳与青方腐乳之间特征差异物质有5个，白方腐乳与红方腐乳之间有21个，青方腐乳与红方腐乳之间有3个。利用NIST14数据库对上述物质进行定性，结果显示；在检测腐乳风味的过程中，青方腐乳相较红方腐乳，红方腐乳中的辛酸乙酯与青方中的吲哚两种物质对样本差异的影响最大；白方腐乳与红方腐乳相比，红方腐乳中的苯乙醇、正十二烷，白方腐乳的中茴香脑、2,4-二叔丁基苯酚，使得二者有着明显差异；青方腐乳与白方腐乳相比，青方中的丙酸丁酯、吲哚最能体现其差异。通过统计分析得出白方腐乳中的茴香脑、青方腐乳中的吲哚是它们各自的特征风味物质。由于不同物质的呈味阈值并不相同，所以还需进一步实验进行验证。

3 结论

本研究采用SDE法和HS-SPME法与GC-MS联用分析3种腐乳的挥发性风味成分，并通过统计学方法寻找差异物质。结果表明，3种腐乳因为发酵菌种、生产工艺的不同，其挥发性风味物质有着较大差异，苯酚、对乙基苯酚、苯乙醇、桉叶油醇、二叔十二烷基二硫化物、植烷、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、硬脂酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕榈酸、苯乙醇、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸等物质均存在于3种腐乳中，对腐乳的风味有着一定的贡献。红方腐乳的酯类物质种类最多，酮类物质和醛类物质的含量最高，在其中检测出了苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、3-甲硫基丙醛、壬醛、2-苯基巴豆醛等特有的物质。青方腐乳样品中含有含量最高的酚类物质和含硫类物质，吲哚的存在使得青方腐乳明显区分于另外两种腐乳。白方腐乳的醇类物质含量最高，其中茴香脑、芳樟醇、松油醇、石竹烯、柠檬烯等是只在白方腐乳中检测出的物质，而且茴香脑是白方腐乳中的特征物质。腐乳之间不同的挥发性风味成分区别较大，为进一步确定不同腐乳风味成分的研究提供了基础。