基于木脂素生物合成的内生菌发酵五味子研究

许哲祥，刘玉洁，刘松梅*，郑春英*

(1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)，又名 “山花椒”，是药食同源功能性保健食品[1]，因其酸、苦、甘、辛、咸五味俱全，其加工产品能保持五味子红色素的鲜亮[2]，无需添加任何色素成分，因此民间常采用五味子代替花椒作为调味品使用。现代研究表明：五味子具有降血糖、镇静、止咳、缓解疲劳等作用[3-5]，其主要活性成分是以五味子醇甲为代表的木脂素成分，该类成分具有抗肿瘤、保护中枢神经、抗氧化、抗菌等作用[6-9]，是绿色食品、药品的生产原料及功能型调味品的重要生产原料[10]。

寒地黑土造就了北方道地药材五味子的优良品质、生物活性及保健、调味功能，由于无节制的采集使用，五味子现为北方濒危药用植物[11]。本文基于内生菌参与宿主植物体内成分的生物转化、诱导药用植物次生代谢产物的产生的观点[12]，采用五味子内生菌发酵五味子，定向高效生产五味子木脂素成分；同时采用柱色谱法同时分离发酵五味子中4种木脂素成分，以最大限度地使用五味子原料，并为功能性调味品的生产提供精制原料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康野生五味子：采自黑龙江省尚志地区；五味子内生真菌WJ1、WT4、TP2与GP5：由黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室分离自健康五味子植株； PDA培养基的配制方法参阅文献[13]。4种五味子对照品(供含量测定用)：中国药品生物制品检定院。

1.2 仪器与设备

FL2200型高效液相色谱仪 浙江温岭福立分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵菌株的筛选

发酵样品的制备：取已活化的五味子内生真菌WJ1、TP2、WT4与GP5，参阅文献[14]，制备1×107CFU/mL的菌悬液；精确称取五味子粉9 g(过40目筛)，置于三角瓶中，加水(料液比1∶5)，密封，作为底物(121 ℃高压灭菌30 min)；分别取上述4种菌悬液及无菌水各5 mL加入到底物中(平行样品制备10份)，置于空气浴摇床中，发酵培养(培养条件：28 ℃，140 r/min，培养15 d)，取出，冻干，作为发酵样品，备用。

发酵前后五味子木脂素成分的动态变化：采用HPLC法，方法及条件参阅文献[15]。

对照品溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制备1.0 mg/mL的五味子木脂素(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)对照品储备液；吸取各对照品储备液1 mL，制成0.25 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

供试品溶液的制备：分别精密称取上述各发酵样品及生药五味子1.0 g，以10 mL甲醇超声提取60 min，取出，放冷，以甲醇补足减失的溶剂，过滤(0.45 μm微孔滤膜)，即为供试品溶液。

HPLC测定：分别精密吸取上述对照品溶液及供试品溶液10 μL(n=3)，进样，测定，计算含量的动态变化。

1.3.2 发酵五味子中木脂素成分的分离

根据“1.3.1”筛选结果，取发酵菌株，按“1.3.1”方法制备五味子发酵样品，取五味子发酵样品200 g，80%乙醇(料液比1∶8)，85 ℃回流提取2次(每次2 h)，合并提取液，减压回收溶剂至100 mL时，用乙酸乙酯(100 mL)萃取3次，萃取液浓缩至清膏(相对密度约为1.10)，将其通过硅胶柱层析，依次采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，分离工艺流程见图1。

图1 发酵五味子中4种木脂素成分的分离流程Fig.1 The separation process of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis

1.3.3 发酵菌株的鉴定

参阅文献[16]采用形态学观察、18S rDNA序列扩增及序列分析法。通用引物NS1、NS6及PCR产物测序均委托生工生物工程(上海)股份有限公司。所得序列数据提交GenBank 数据库，采用Blast分析与GenBank中核酸序列进行比较，通过MEGA 6.0软件构建系统发育树，进行亲缘关系和系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 发酵菌株筛选结果

采用HPLC法，分别采用“1.3.1”中的4株五味子内生真菌发酵五味子后，其所含4种木脂素成分(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)含量发生了动态变化(此4种木脂素HPLC色谱峰分别采用对照品加入法得到确认)，其中以五味子内生真菌WJ1发酵五味子后，4种五味子木脂素成分提高显著，结果见图2；五味子发酵后4种木脂素成分含量测定结果见表1和图3。

图2 内生真菌WJ1发酵五味子后的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of Schisandra chinensis fermented by endophytic fungus WJ1

注：A为混合对照品；B为五味子生药；C为WJ1发酵五味子样品；1为五味子醇甲；2为五味子酯甲；3为五味子甲素；4为五味子乙素。

由图2可知，与生药五味子相比，五味子经内生真菌WJ1发酵后，其4种木脂素成分含量发生显著增长，并以五味子指标成分五味子醇甲的增长最为显著；同时，对比图1不难发现，五味子在发酵过程中还有其他成分的产生，说明五味子在发酵过程中发生了活性成分的动态变化。

表1 五味子发酵样品中4种木脂素含量测定结果Table 1 Determination results of the content of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis samples mg/g

注：同生药对照组相比，“*”为P<0.05，“**”为P<0.01；同阴性对照组相比，“△”为P<0.05，“△△”为P<0.01。组别1：WJ1发酵样品；组别2：TP2发酵样品；组别3：GP5发酵样品；组别4：WT4发酵样品；组别5：五味子生药；组别6：空白对照组。

图3 五味子发酵样品4种木脂素含量测定结果Fig.3 Determination results of the content of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis samples

注：组别同表1。

由表1和图3可知，4株五味子内生真菌(WJ1、TP2、WT4和GP5)均能在某种程度上使发酵五味子样品中4种主要木脂素活性成分得以提高，并以内生真菌WJ1的作用效果最明显，与生药五味子相比，WJ1发酵五味子样品中4种木脂素(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素及五味子乙素)含量都得到显著增长，其增长率分别为：38.21%、27.24%、25.03%、39.70%，而且均高于其他3株内生菌发酵样品中活性成分的涨幅(P<0.01)。因此，选取菌株WJ1作为目的菌株发酵五味子，以最大化提高五味子中4种木脂素成分含量。

2.2 发酵五味子中木脂素成分的分离结果

采用对照品跟踪法对WJ1发酵五味子中4种木脂素成分进行分离，随行薄层层析检视，合并相同组分，所得4个部位，分别记作Fr1～Fr4，Fr1减压浓缩，重结晶得到五味子乙素(613.4260 mg，纯度96%)；Fr2减压浓缩，重结晶得到五味子甲素(348.3487 mg，纯度95%)；Fr3减压浓缩，重结晶得到五味子酯甲(128.4508 mg，纯度97%)；Fr4减压浓缩，粗品以AB-8大孔树脂柱(1.5 cm×12 cm)纯化，以20%乙醇(V/V)洗脱，所得粗结晶以乙醚-乙酸乙酯(1∶1)重结晶后得到五味子醇甲(1614.3684 mg，纯度98%)。

上述结果说明，采用一次柱色谱分离法可以同时分离发酵五味子中4种主要木脂素成分，该工艺适合木脂素原料的生产。柱色谱分离法为五味子中木脂素成分分离的经典方法，尽管众多文献报道了五味子中木脂素成分的分离鉴定[17]，但涉及到一次柱层析同时分离五味子中4种主要木脂素成分的方法却鲜有报道，本文采用硅胶柱层析方法同时分离纯化发酵五味子中4种主要木脂素成分，为制备4种主要木脂素成分奠定了基础。

2.3 五味子内生真菌WJ1鉴定结果

对五味子内生真菌WJ1进行形态观察，在PDA培养基上，菌株生长迅速，最初呈白色，随后密生小颗粒状黑褐色孢子逐渐增加，菌丝致密，出现头球状分生孢子，孢子呈球形；基内菌丝无色，无可溶性色素。参阅《真菌鉴定手册》[18]，初步认定WJ1菌株为丝孢科曲霉属菌，结果见图4。

(a) (b)(10×40)

WJ1菌株PCR扩增获得1条 1284 bp的特异性条带，将所得测序结果在GenBank中进行Blast同源性比对，然后用MEGA 6.0软件构建系统发育树(见图5)，WJ1与菌株AspergillusnigerHM347449.1的18S rDNA序列的同源性最高，相似性为99%。综合菌体形态学鉴定结果，初步认定WJ1为黑曲霉(Aspergillusniger)。关于黑曲霉在调味品中的应用已有报道[19,20]，上述研究结果为深入开发WJ1奠定了基础。

图5 WJ1菌株的系统发育树Fig.5 The phylogenetic tree of strain WJ1

3 结论

本研究采用内生真菌发酵五味子，旨在高效利用有限五味子资源生产五味子中4种主要木脂素成分，同时采用柱色谱分离法对发酵五味子中4种木脂素成分进行了分离纯化，并对发酵菌株进行了鉴定。结果表明，采用五味子内生真菌WJ1发酵五味子后，五味子中4种主要木脂素成分(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)含量均较发酵前得到了显著提高，尤以五味子指标成分五味子醇甲含量提高最为显著，上述研究说明：内生菌发酵法可定向转化五味子中木脂素成分；同时，采用柱色谱分离法分离发酵五味子中4种主要木脂素成分工艺适合木脂素原料的工业化生产。上述研究对于功能性调味品的生产，可减少配方中五味子原料的使用，起到精制作用；同时，对具有潜在应用价值的发酵菌株WJ1进行了菌株鉴定，后续可利用该菌株固体发酵五味子，以改善五味子调味品中挥发性风味物质的含量和种类，为研制新型功能性调味品奠定基础。