近冰温贮藏对杏果实冷害及活性氧代谢的影响

2020-04-25李亚玲崔宽波祝兆帅

食品科学 2020年7期

李亚玲，崔宽波，石玲，祝兆帅，李玲，刘严，朱璇,*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院农业机械化研究所，新疆乌鲁木齐 830091）

杏（Prunus armeniaca L.）为杏属，在新疆林果业中占据重要的地位[1]。据2017年数据统计，全疆杏树栽培总面积达12万公顷，产量为115万 t，占新疆水果总产量的11.37%[2]。杏果实属于呼吸跃变型果实，且采收季节较为集中，多为高温季节，采后在常温下放置会迅速后熟衰老，导致果实出现严重的腐烂[3]。低温贮藏可有效抑制杏果实采后品质下降和腐烂变质，由于杏果实属于冷敏性果实，在不适宜的低温下贮藏，容易导致冷害的发生[4]。冷害症状一般是从低温环境被转移到温暖的环境下才易被发现，果实受到冷害后又易被病原微生物所浸染，其贮藏品质及商品价值将会受到严重的影响[5]。因此，控制杏果实采后贮藏冷害的发生，寻求简单、高效的贮藏保鲜技术己成为杏贮运产业中亟需解决的问题。

近冰温贮藏是指将果蔬贮藏在其冰点以上、0 ℃以下温度范围内的一种非冻结保鲜技术[6]。当果蔬贮藏在其冰点附近时，果蔬内部细胞组织不会被破坏，且呼吸代谢作用可被降至最低限度，能最大程度地抑制果蔬的生命活动，从而维持其贮藏品质，延长贮藏期，是一种安全、绿色的保鲜技术[7-8]。研究表明，近冰温贮藏可最大程度地延缓蓝莓[9-10]、冬枣[11]、油桃[12]营养成分的损失，抑制果实采后褐变的发生，较好地保持其品质，延长贮藏期。近冰温贮藏条件下的小白杏[13]、樱桃[14]的腐烂率也明显受到抑制。近冰温贮藏还能有效提高吊干杏[15]、黄花梨[16]、西兰花[17]、樱桃[18]等果蔬的抗氧化能力和抗冷性，但抗冷性机理需要进一步研究。本实验以新疆库车小白杏为试材，研究近冰温贮藏对采后杏果实冷害及活性氧的影响，为杏果实近冰温贮藏保鲜技术提供理论参考和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小白杏于2018年6月27日购自新疆乌鲁木齐市九鼎农贸市场，选取无损伤、色泽大小匀称、成熟度（硬度为（8.3±0.1）kg/cm2、可溶性固形物质量分数为（13.3±0.2）%）相近的果实进行实验。

乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、冰醋酸、浓氨水、硫酸、四氯化钛、硫代巴比妥酸、盐酸、丙酮、氮蓝四唑、三氯乙酸、无水醋酸钠、愈创木酚等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SHB-III循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司；DDS-307型电导率仪上海仪电科学仪器股份有限公司；RC-4温度记录仪江苏省精创电气股份有限公司；FE22-Meter pH计、AL204-IC电子分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZKW-S-6电热恒温水浴锅北京市永光明医疗仪器厂；3H16RI智能高速冷冻离心机湖南赫西仪器装备有限公司；UV-1700型紫外-可见分光光度计上海美析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

分级挑选后的果实，放置在（5±1）℃的环境下预冷24 h。果实共分为3 组，每组重复3 次，每个重复4 kg，入库之前用厚度为0.03 mm的聚乙烯袋进行包装。分别放入近冰温（－1.5～－1.0 ℃）、冷藏（1～2、4～6 ℃）下进行贮藏。以冷藏作为对照，冷藏期间每隔7 d取样测定相关指标。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 杏果实冰点的测定

参照崔宽波等[13]的方法，使用RC-4温度记录仪，将记录仪的金属探头完全刺入果实中心部位，将果实放入－18 ℃的冷冻库中，记录仪检测果实内温度波动，每10 s自动记录一次温度变化，待果实完全冻结后将RC-4温度记录仪中的数据导入计算机中，根据温度曲线确定果实冰点温度。

1.3.2.2 冷害指数的测定

果实冷害主要表现为表面出现水浸状斑、凹陷、皱缩等现象。因此，以水浸状斑、表面皱缩来界定冷害程度。参照Dong Li等[19]的方法并稍加改进，将冷害面积分为5级：0级，无冷害发生；1级，冷害发生面积5%～15%；2级，冷害发生面积在15%～25%之间；3级，冷害发生面积25%～50%；4 级，冷害面积50%～75%；5级，冷害面积不小于75%。按公式（1）计算冷害指数。

1.3.2.3 冷害发病率的测定

以单个果实表面出现冷害程度达1级以上记为发病果，统计发病果数占总果数的比例。按公式（2）计算冷害发病率。

1.3.2.4 过氧化氢酶活力的测定

过氧化氢酶（catalase，CAT）活力的测定参照曹建康等[20]的方法，采用比色法进行测定，以每分钟每克鲜质量杏果实在240 nm波长处吸光度变化0.01为1 个CAT活力单位（U），结果以U/g表示。

1.3.2.5 H2O2含量的测定

H2O2含量参照Zhou Biyan等[21]的方法进行测定。

1.3.2.6 超氧化物歧化酶活力的测定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的测定采用氮蓝四唑法[22]，以每分钟每克鲜质量果蔬组织的反应体系抑制氮蓝四唑光化还原反应50%时为一个SOD活力单位（U），结果以U/g表示。

1.3.2.7 超氧阴离子自由基产生速率的测定

超氧阴离子自由基（O2－·）产生速率参照Lin Yifen等[23]的方法测定。以每分钟每克鲜质量果蔬组织产生的O2－·物质的量作为其产生速率，单位为nmol/（min·g）。

1.3.2.8 过氧化物酶活力的测定

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力用愈创木酚氧化法[20]测定。以每克鲜质量果蔬样品在470 nm波长处吸光度每分钟增加1时为1 个POD活力单位（U），POD活力记为U/g。

1.3.2.9 丙二醛含量的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量参照Kang Ruoyi等[24]的方法测定，单位为nmol/g，结果以鲜质量计。

1.3.2.10 细胞膜透性的测定

细胞膜透性的测定参照曹建康等[20]的方法，采用电导率法，单位用%表示。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，并用邓肯氏多重比较进行差异分析，P＜0.05表示差异显著，作图采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 杏果实冰点

图1 杏果实冰点曲线Fig. 1 Freezing curves of apricot fruit

果实中含有可溶性糖、矿物质、有机酸等物质，使果实实际冰点温度低于0 ℃，确定果实冰点温度是进行近冰温贮藏的重要基础。由图1可知，将果实放入冷冻库后杏果实的温度随时间的延长迅速下降直至过冷点（－3.2 ℃）开始出现冻结现象，此时果实将会释放出潜热，使温度迅速回升，一段时间内温度不发生变化，此温度为杏果实生物结冰点（－2 ℃）。而库体温度不稳定时，易造成果实冻害，本冷库温差波动在0.3 ℃以内，为防止冻害现象的发生，本实验以－1.5～－1.0 ℃为杏果实近冰温贮藏温度。

2.2 近冰温贮藏对杏果实冷害发病率的影响

图2 不同贮藏温度对杏果实冷害发病率的影响Fig. 2 Effects of storage temperatures on chilling injury incidence of apricot fruit

由图2可知，近冰温贮藏组冷害发生时间分别比4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组推迟了21 d和7 d，并且冷害发病率也显著低于4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组。在冷藏期间，冷害发病率随贮藏时间的延长不断上升，果实表面也出现不同程度大小的凹陷和水浸斑等现象。4～6 ℃贮藏组在冷藏前期发病并不明显，而在21 d时冷害发病率迅速上升，在49 d时冷害发病率已达到40.70%。1～2 ℃贮藏组则在28 d发生冷害，比4～6 ℃贮藏组推迟了14 d发生。冷藏第49天时，1～2 ℃贮藏组冷害发病率为31.30%，而近冰温贮藏的杏果实冷害发病率为16.50%。比4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组分别低59.46%和47.28%（P＜0.05）。说明近冰温贮藏可明显抑制杏果实冷害发病率的升高并有效推迟冷害发病时间。

2.3 近冰温贮藏对杏果实冷害指数的影响

图3 不同贮藏温度对杏果实冷害指数的影响Fig. 3 Effects of storage temperatures on chilling injury index of apricot fruit

冷害是造成果实采后冷藏品质下降的重要原因之一。由图3可知，4～6 ℃和1～2 ℃贮藏的杏果实分别在14 d和28 d时出现冷害症状，而近冰温贮藏的杏果实推迟到35 d才发生冷害症状。冷藏期间，随贮藏时间的延长，冷害指数不断上升，但近冰温贮藏下的杏果实冷害指数始终低于4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组。冷藏第49天时，4～6 ℃和1～2 ℃贮藏的杏果实冷害指数分别为0.47和0.36，而近冰温贮藏的杏果实为0.18，分别比4～6 ℃和1～2 ℃贮藏的果实冷害指数低61.70%和50.00%（P＜0.05）。说明近冰温贮藏与普通冷藏相比可较好地控制杏果实冷害指数的上升。

2.4 近冰温贮藏对杏果实冷藏期间H2O2含量的影响

图4 不同贮藏温度对杏果实HH2O2含量的影响Fig. 4 Effects of storage temperature on H2O2 content of apricot fruit

H2O2是植物体内活性氧的一种，当活性氧清除系统代谢不平衡时，H2O2将会大量累积攻击膜系统使细胞膜结构受到破坏。由图4可知，冷藏0～14 d时，近冰温贮藏与1～2 ℃下冷藏的杏果实H2O2含量无显著差异。冷藏21 d后，各组H2O2含量缓慢上升，但近冰温贮藏的杏果实H2O2含量始终低于4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组。在冷藏第49天时，4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组杏果实的H2O2含量分别为20.62 μmol/g和15.93 μmol/g，比近冰温贮藏组（12.86 μmol/g）分别高60.34%（P＜0.05）和23.87%（P＜0.05）。说明近冰温贮藏可抑制H2O2含量的升高，从而降低对杏果实细胞组织的损伤。

2.5 近冰温贮藏对杏果实冷藏期间CAT活力的影响

图5 不同贮藏温度对杏果实CAT活力的影响Fig. 5 Effects of storage temperature on CAT activity of apricot fruit

CAT是清除活性氧的主要酶类，可将果实体内过多累积的H2O2分解，使H2O2含量维持在较低水平，进而减轻对细胞组织的毒害。由图5可知，在冷藏初期各组CAT活力均呈缓慢上升趋势，但冷藏28 d后，4～6 ℃和1～2 ℃的CAT活力开始持续下降，且35 d时，4～6 ℃贮藏组比近冰温贮藏的杏果实CAT活力低13.95%（P＜0.05），并且在整个冷藏期间近冰温贮藏的杏果实CAT活力始终高于4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组。冷藏第42天时，近冰温贮藏的杏果实CAT活力分别比4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组高1.0 倍和38.15%（P＜0.05），说明近冰温贮藏能够较好地延缓杏果实CAT活力的下降。

2.6 近冰温贮藏对杏果实冷藏期间O2—·产生速率的影响

图6 不同贮藏温度对杏果实·产生速率的影响Fig. 6 Effects of storage temperature on · production rate of apricot fruit

2.7 近冰温贮藏对杏果实冷藏期间SOD活力的影响

图7 不同贮藏温度对杏果实SOD活力的影响Fig. 7 Effects of storage temperature on SOD activity of apricot fruit

SOD是植物细胞组织中较为重要的抗氧化酶类，与POD、CAT、APX等相互协同清除活性氧，使果实采后耐贮性增强。由图7可知，各组杏果实SOD活力均呈先上升后下降的趋势，冷藏第28天时各组SOD活力均达到最高峰，此时近冰温贮藏的杏果实为0.87 U/g，分别比4～6 ℃（0.74 U/g）和1～2 ℃（0.76 U/g）贮藏组杏果实的SOD活力高17.57%（P＜0.05）和14.47%（P＜0.05）。并且在冷藏期间近冰温贮藏的杏果实SOD活力始终高于4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组，且在冷藏结束时仍能保持较高活力。说明杏果实在近冰温环境下贮藏可显著提高SOD的活力。

2.8 近冰温贮藏对杏果实冷藏期间POD活力的影响

图8 不同贮藏温度对杏果实POD活力的影响Fig. 8 Effects of storage temperature on POD activity of apricot fruit

POD是植物体内存在的主要氧化还原酶类，其作用是清除H2O2，减轻对细胞组织的伤害，维持细胞膜结构的稳定。由图8可知，冷藏前期，各组杏果实POD活力逐渐上升，4～6 ℃和1～2 ℃均在14 d到达高峰，随后缓慢下降；而近冰温贮藏组则在21 d达到高峰，且POD的活力始终高于4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组。在冷藏第49天时，近冰温贮藏的杏果实POD活力为0.72 U/g，分别比4～6 ℃（0.56 U/g）和1～2 ℃（0.65 U/g）贮藏的杏果实POD活力高28.57%（P＜0.05）和10.77%%（P＜0.05）。说明近冰温贮藏显著延缓了POD活力的降低，使杏果实在冷藏结束时仍保持较高的POD活力。

2.9 近冰温贮藏对杏果实冷藏期间MDA含量的影响

图9 不同贮藏温度对杏果实MDA含量的影响Fig. 9 Effects of storage temperature on MDA content of apricot fruit

MDA是膜脂过氧化的主要产物，影响膜的结构和扰乱正常生理代谢。由图9可知，杏果实MDA含量在贮藏过程中呈逐渐上升趋势。冷藏前期，近冰温贮藏的杏果实MDA含量上升较为缓慢，在冷藏21 d后才显著增长，而4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组则在14 d后就持续上升。在冷藏期间，近冰温贮藏的杏果实MDA含量始终低于4～6 ℃和1～2 ℃贮藏组。冷藏第49天时，而近冰温贮藏的杏果实MDA含量为0.93 nmol/g，分别比4～6 ℃（1.26 nmol/g）和1～2 ℃（1.13 nmol/g）贮藏的杏果实MDA含量低26.19%（P＜0.05）和17.70%（P＜0.05）。说明近冰温贮藏能显著抑制杏果实冷藏期间MDA含量的增加，从而减轻对细胞膜的伤害，减少了冷害的发生。

2.1 0 近冰温贮藏对杏果实冷藏期间细胞膜透性的影响

图10 不同贮藏温度对杏果实细胞膜透性的影响Fig. 10 Effects of storage temperature on membrane permeability of apricot fruit

细胞膜对植物的正常代谢及微环境的稳定有着重要的意义，细胞膜透性可反映植物遭受冷害的程度[25]。由图10可知，在冷藏期间杏果实的细胞膜透性呈上升趋势，但近冰温贮藏的杏果实细胞膜透性始终低于4～6 ℃和1～2 ℃组。冷藏0～21 d期间，近冰温贮藏和1～2 ℃贮藏的杏果实细胞膜透性增加并不明显，21 d后，1～2 ℃贮藏的杏果实细胞膜透性缓慢上升，而近冰温贮藏组则在28 d后细胞膜透性才呈逐渐升高，4～6 ℃冷藏的杏果实细胞膜透性在14 d后已迅速上升。在冷藏第35天和第49天时，4～6 ℃冷藏下的杏果实细胞膜透性分别为54.11%和65.00%，分别比近冰温贮藏的杏果实细胞膜透性高26.86%（P＜0.05）和29.72%（P＜0.05）。说明近冰温贮藏可明显抑制膜脂过氧化对细胞膜造成的损伤，保持细胞膜的完整性，提高杏果实的耐冷性。

3 讨论

贮藏温度是影响果实贮藏品质的重要因素之一。研究发现某些果蔬在其生物结冰点附近贮藏的效果明显优于0 ℃以上的温度[26]。果蔬细胞内的糖、有机酸、矿物质等溶质分子使果实实际冰点低于0 ℃，而细胞内的高分子物质以空间网状结构存在，水分子扩散受到了极大的阻碍，使果蔬产生回避冻结现象[8]。因此，果蔬可在0 ℃以下的近冰温范围内贮藏，使细胞处于既不冻结也能保持活体状态。本实验结果表明，4～6 ℃和1～2 ℃下贮藏的杏果实分别在14 d和28 d呈现出不同大小的水浸状斑和凹陷症状，而近冰温贮藏（－1.5～－1.0 ℃）的杏果实49 d后仅出现少许果梗处皱缩，比4～6 ℃和1～2 ℃组分别推迟了21 d和7 d才发生冷害症状，且冷害指数和冷害发病率也明显低于4～6 ℃和1～2 ℃组，这与Liu Bangdi等[27]在杏梅上的研究结果相似。有研究也发现，蜜桃在3～4 ℃下贮藏30 d后褐变率达到47.45%，同时发生严重的絮化，（0.0±0.5）℃贮藏40 d褐变严重并出现絮化，而近冰温（－0.8 ℃）贮藏40 d基本未发生褐变和絮化，较好地保持了贮藏品质[28]。刘东杰[29]研究也发现近冰温贮藏可有效降低番茄的冷害指数和减轻青椒的冷害发病率。

低温引起植物细胞膜结构受损是造成冷害的根本原因。在低温逆境条件下，膜脂由液晶态转变为凝胶态，膜的结构和功能发生改变，进而引起一系列次级反应，导致冷害的发生[30]。研究表明，果蔬冷害的发生与活性氧的代谢有着密切关系[31]。O2－·、H2O2是主要的活性氧，在低温胁迫的条件下过多累积会使膜脂过氧化进程加快，破坏细胞膜的结构及功能，从而使果蔬表现出代谢失衡及膜透性增加，引起冷害的发生[32]。而果蔬在长期的进化过程中形成了活性氧清除系统，CAT、SOD、POD是清除自由基的主要抗氧化酶类[33]。SOD、CAT和POD相互协调使活性氧维持在较低水平，以减少其对细胞膜的损伤[34]。适宜的近冰温贮藏不仅可以抑制乙烯的产生和呼吸速率，而且果蔬在近冰温条件下自由基清除系统仍具有较高活力，能有效地防止膜脂过氧化和MDA的积累，保护膜结构不受损伤[8,26]。

本实验结果表明，与普通冷藏相比，在稳定的近冰温环境下贮藏能有效地促进抗氧化酶SOD活力的增加，延缓CAT、POD活力的降低，并抑制H2O2和·的产生，说明近冰温贮藏可诱导抗氧化酶活力，有效抑制自由基的累积。近冰温贮藏条件下较高的抗氧化酶活力对减轻膜脂过氧化有积极的作用，能有效减缓杏果实MDA含量和膜透性的增加，维持细胞膜的稳定，从而抑制杏果实贮藏期间冷害的发生。Zhao Handong等[18]对樱桃的研究表明近冰温（（－0.3±0.1）℃）贮藏可显著提高抗氧化酶SOD、CAT、POD活力，并抑制H2O2和·的产生，维持果实细胞膜的稳定，认为樱桃的抗氧化能力与冷害症状的发生呈负相关。对吊干杏（－1.7～－2.5 ℃）[15]、杏梅（（－1.7±0.2） ℃）[27]、金冠苹果（（－1.7±0.2）℃）[35]、黄花梨（－1 ℃）[16]、生菜（（－0.5±0.2）℃）[36]的研究均表明近冰温贮藏可保持较高的抗氧化能力，抑制H2O2和·的产生，减缓细胞膜透性和MDA含量的增加。近冰温条件下冷害的减轻是由于抗氧化酶活性的增加可有效清除过多累积的活性氧自由基，从而减轻冷胁迫下造成的损伤，基于其复杂性，后续实验还需更进一步研究完善相关理论。