表面糊化处理确定乙酰化羟丙基小麦淀粉中取代基团分布

赵 凯，刘 宁，李 君，雷 鸣，陈 威，杨春华，陈凤莲

（哈尔滨商业大学 省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

小麦是我国主要的粮食作物，广泛种植于华北及东北地区。淀粉是小麦中含量最高的组分，占70%以上，对小麦粉的加工及贮藏品质具有重要影响。为了改善小麦淀粉的加工品质，拓展其应用范围，经常采用酯化及醚化进行改性处理，制备乙酰化（醋酸酯）小麦淀粉、羟丙基化小麦淀粉[1-3]。这些接入的具有空间位阻作用的基团能提高淀粉亲水特性，降低淀粉的糊化温度，改善淀粉的冻融稳定性及淀粉糊的透明度[4]。目前，业内一般采用取代度来评价酯化及醚化淀粉的改性程度[5]，但是取代度仅能从量上反映取代程度，具体取代基团在淀粉颗粒内如何分布，是从淀粉表面到颗粒内部均匀分布还是集中在某一区域，通过取代度还无法做出判断。如果想了解取代基团在颗粒内的分布情况，可采用表面糊化技术从淀粉表面到内部逐层糊化淀粉颗粒，一般选用高浓度的氯化钙或氯化锂，通过化学糊化的方法对淀粉颗粒实现逐层剥离、控制糊化程度，进而分析表面糊化的淀粉和剩余淀粉颗粒内取代基团的含量，来确定反应发生在表面还是颗粒内部[6-7]。Jane等采用表面糊化技术分析直链淀粉在马铃薯淀粉颗粒内的分布，结果表明，直链淀粉主要分布在淀粉颗粒的表面，尤其是短直链淀粉，而链长较长的直链淀粉则伸展到颗粒内部[8]。Kuakpetoon等采用表面糊化技术研究了玉米淀粉颗粒内部结构，结果表明直链淀粉-脂质复合物主要集中在颗粒表层[9-10]。Huang Junrong等研究了乙酰基在乙酰化（醋酸酯）淀粉颗粒内取代基的分布[11]。Li Lingjin等研究了酸水解羟丙基复合改性马铃薯淀粉颗粒结构及流变学特性的影响，揭示出淀粉经酸水解处理后可提高羟丙基淀粉取代度[12]。而对于乙酰化羟丙基复合改性处理过程中取代基团在淀粉颗粒内的分布及表面糊化处理后淀粉分子质量分布的变化，则国内外研究较少。

本实验采用表面糊化法研究单一及复合改性条件下取代基团在淀粉颗粒内的分布，进而研究表面糊化处理后淀粉的颗粒特性、分子质量的变化以及直链淀粉的含量与分布，以期为改性淀粉在食品工业中的进一步应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦淀粉 青岛百乐麦食品有限公司；小麦总淀粉、小麦A淀粉、小麦B淀粉、羟丙基淀粉、乙酰化（醋酸酯）淀粉、乙酰化羟丙基淀粉由哈尔滨商业大学省高校食品科学与工程重点实验室自制；琼脂糖凝胶CL-2B瑞典Pharmacia LKB公司；浓硫酸、苯酚、水合茚三酮、亚硫酸氢钠、硫酸钠、氢氧化钠、环氧丙烷、醋酸酐、盐酸、酚酞、叠氮钠、无水乙醇均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

VersaMax酶标仪 美国Molecular Devices公司；ALC-2100电子分析天平 上海精密仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州市亚荣仪器有限公司；TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器厂；DHG-9420A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；FW80-I高速万能粉碎机 天津市泰斯有限公司；SU8000扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；SBS-160F自动部分收集器 上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小麦淀粉不同组分分离

参考文献[13-14]对小麦淀粉不同组分进行分离。

1.3.2 乙酰化淀粉、羟丙基淀粉及乙酰化羟丙基复合改性淀粉的制备

参考文献[15-18]对乙酰化淀粉、羟丙基淀粉及乙酰化羟丙基复合改性淀粉进行制备。

1.3.3 表面糊化淀粉的制备

精确称量小麦淀粉7.5 g，悬浮于17.5 mL 4 mol/L的无水氯化钙中，在温度为21 ℃的磁力搅拌器中160～200 r/min搅拌一定时间，加入0 ℃冰水混合物后，8 000 r/min离心20 min，弃上清液，将沉淀用1 L蒸馏水洗涤15～25 min，去除残留氯化钙后离心[8,19]。

1.3.4 淀粉糊化率的测定

将处理后的淀粉悬浮于200 mL蒸馏水中，高速（960～1 000 r/min）搅拌10 min，此过程重复5 次，静置30 min，小心倒出上清液， 分离糊化淀粉。重新注入200 mL蒸馏水，将上述过程重复一次。沉淀用无水乙醇洗涤2 次，离心，然后将其放入40 ℃的烘箱中干燥，上清液经旋转蒸发去除水分后，用10 倍体积无水乙醇洗涤，8 000 r/min离心30 min后收集糊化淀粉，无水乙醇洗涤2 次后于40 ℃的烘箱中干燥[8,19]。按下式计算淀粉糊化率。

1.3.5 取代度测定

参考文献[20-21]测定取代度。

1.3.6 凝胶渗透色谱测定分子质量分布

参考文献[22]，采用凝胶渗透色谱测定分子质量分布。

1.3.7 总糖含量的测定

通过苯酚-硫酸法进行总糖含量的测定，取1 mL样品（含总糖10～100 μg）加入1 mL体积分数5%的苯酚溶液，混合，加入5 mL浓硫酸后混合均匀，置于室温保持20～30 min，在490 nm波长处测定吸光度[23]。

1.3.8 淀粉蓝值测定

取200 μL样品注入96 孔酶标板，加入200 μL碘溶液，混合，使用VersaMax酶标仪在630 nm波长处测定吸光度[23]。

1.3.9 直链淀粉质量分数的测定

根据凝胶渗透色谱图，利用面积法计算出直链淀粉质量分数[23]。

1.3.10 淀粉颗粒形貌分析

利用SU8000扫描电子显微镜，将待测样品用双面胶固定在样品台上，采取离子溅射法在样品的表面镀金。分析条件为：喷金180 s，电流20 mA。

1.4 数据统计与分析

采用Origin 9.0软件处理数据并进行绘图。

2 结果与分析

2.1 小麦淀粉颗粒形貌分析结果

图1 表面糊化处理前后小麦淀粉颗粒形貌Fig. 1 Granule morphology of the wheat starches before and after surface gelatinization

图1 A～C分别为小麦总淀粉及小麦A淀粉、B淀粉的扫描电子显微镜照片，可以看出小麦A淀粉的颗粒呈圆盘形、扁球形，颗粒表面比较光滑，无明显孔洞及破损；B淀粉形状并不均匀一致，其不完整程度和边缘破损程度均较A淀粉高，B淀粉颗粒间有团聚现象，在数量上明显多于A淀粉，这与文献[24-26]观察到的结果一致。图1D～E为表面糊化处理30、45 min后剩余A淀粉颗粒，外层糊化淀粉移除后颗粒大小有所减小，且表面较为粗糙，有明显的剥蚀现象，这表明氯化钙溶液主要作用于淀粉颗粒表层，糊化后在机械力作用下，淀粉从表层脱落，剩余淀粉颗粒的结构仍被保留。图1F为表面糊化处理后表层剥离的糊化淀粉，可以看到这部分淀粉已经完全失去颗粒结构，呈现不规则形状。

2.2 小麦淀粉分子质量分布分析结果

凝胶渗透色谱法不但能应用于不同组分的分离与鉴定，还可用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。一般按照淀粉分子流出凝胶柱的先后顺序将淀粉的组成分为高分子质量级分、中间级分和低分子质量级分；前者主要为支链淀粉，其峰形尖锐，相对分子质量分布相对较为集中；后者为直链淀粉，由许多不同聚合度的直链分子组成，多呈现连续分布的状态；而中间级分分布有时不是十分明显，它主要包括了支化度较低的支链淀粉和糊精[27]。

图2 小麦淀粉及其改性淀粉的渗透凝胶色谱图Fig. 2 Gel permeation chromatograms of the native and modified wheat starch

由图2可见，凝胶色谱图呈连续分布状态，主要由直链淀粉与支链淀粉两个部分组成，其中支链淀粉分子摩尔质量较大，约在几百万到几亿g/mol，所以先被洗脱出来；直链淀粉分子摩尔质量较小，约在几万至几百万g/mol，所以后被洗脱出来[28-29]。由图2可以看出，淀粉改性前后分子质量的大小与分布发生了较大变化，原淀粉（图2A～C）的分子质量分布相对集中，支链淀粉的分子质量很大，峰形高且尖锐；直链淀粉峰较宽但高度低，这表明直链淀粉分子是由很多聚合度不同的直链淀粉分子组成，其聚合度呈连续分布。而改性淀粉（图2D～H）的尖峰位置相较于原淀粉均出现推移的现象。由此可说明，随着酯化反应的进行，淀粉的支链发生一定程度裂解，逐渐断裂成支化度更小的分子。此外，改性淀粉的分子质量分布范围逐渐变宽，由凝胶排阻色谱图可以看出，醋酸酐添加量越多取代度越大，对于淀粉分子质量分布影响也越大。高取代度下，改性淀粉分子质量下降愈加明显，意味着淀粉分子降解程度提高。此外，乙酰化羟丙基复合改性淀粉（图2G～H）先醚化再酯化，其中环氧丙烷及醋酸酐对于乙酰化羟丙基淀粉的分子质量分布影响较大，原料羟丙基淀粉，摩尔取代度是0.13，经乙酰化后分子质量分布依然较宽，蓝值明显增加，可能是因为在制备过程中要以酸为试剂，在加热条件下，部分长支链淀粉降解，断裂成不同分子质量的短链淀粉所导致。所以制备乙酰化羟丙基淀粉的分子质量分布也较宽，分子质量也有所降低。

2.3 表面糊化处理后小麦淀粉分子质量分布分析结果

图3 表面糊化处理前后小麦淀粉及乙酰化小麦A淀粉凝胶渗透色谱Fig. 3 Gel permeation chromatograms of the native and modified wheat starches before and after surface gelatinization

由图3可以看出，不论是原淀粉还是改性淀粉，经表面糊化处理后剩余淀粉的蓝值都显著下降，表面糊化处理时间越长，高分子质量的淀粉分子被去除越多，所以蓝值逐渐降低。随着处理时间的延长，支链淀粉分子质量也逐渐降低，可能是淀粉经表面糊化处理后部分的支链淀粉被移除或降解，后者断裂成不同分子质量的短直链淀粉所致；且随着处理时间的延长其蓝值下降愈加明显；其次，与原淀粉相比，表面糊化处理后剩余淀粉的蓝值弥散性显著增大。小麦A淀粉及乙酰化A淀粉经表面糊化处理后剩余淀粉的总糖含量下降显著，这与Jane[8]和Granza[18]等的研究规律一致。

2.4 表面糊化前后小麦淀粉不同组分直链淀粉质量分数与 糊化率分析结果

表1 表面糊化前后小麦淀粉不同组分直链淀粉质量分数及糊化率Table 1 Amylose content and gelatinization degree of the wheat starches before and after surface gelatinization

从表1中可以看出，小麦淀粉各组分经表面糊化处理后直链淀粉质量分数呈下降趋势，并且随着处理时间的延长而逐渐降低；在表面糊化处理30 min后，直链淀粉质量分数为（24.10±0.12）%，下降的速率较快，随后减慢；其次，小麦淀粉各组分经表面糊化处理后，随处理时间延长糊化度呈上升趋势。由表1可知，剩余小麦A淀粉的直链淀粉质量分数要高于剩余小麦B淀粉的，证明随着颗粒增大其直链淀粉质量分数增加，这与Jane[8]、Kuakpetoon[10]和Pan Daodong[19]等之前的报道一致。以上实验结果表明直链淀粉更集中于淀粉颗粒外层，且剩余淀粉有一个较低的直链淀粉质量分数，也证明了CaCl2处理发生在淀粉的外层。

2.5 表面糊化处理单一及复合改性淀粉取代度变化分析结果

由图4可知，乙酰化小麦B淀粉的取代度高于相应的乙酰化小麦A淀粉。这是因为与大颗粒淀粉相比，小颗粒淀粉的比表面积更大，表面的羟基更多，和乙酸酐反应的羟基基团也更多。单一改性及复合改性的淀粉经表面糊化处理后，乙酰化小麦总淀粉剩余淀粉（CaCl2处理30、45、60 min）的取代度分别为0.049、0.035及0.021，羟丙基小麦总淀粉剩余淀粉取代度分别为0.109、 0.087及0.062，乙酰化羟丙基小麦总淀粉剩余淀粉取代度分别为0.05、0.04及0.02。从以上数据可以看出，随着表面糊化处理时间的延长，剩余淀粉颗粒的取代度呈下降趋势。表面糊化处理后外层糊化的程度越高，所获得的剩余淀粉颗粒取代度就越小，表明乙酰化基团的取代反应主要在淀粉颗粒的外层发生，淀粉颗粒中心部位的乙酰基含量均较低，说明颗粒内部发生取代的概率小。因为乙酸酐是一类快速反应剂，在进入到淀粉内部前已经和外部的羟基进行了反应。Chen Zhenghong等研究结果证实淀粉和乙酸酐发生反应时，主要发生在淀粉的无定形区域及结晶区域的外层[6]。Stapley等也证明快速反应试剂会在较大程度上和淀粉颗粒外层的羟基发生反应[30]。

图4 表面糊化处理前后小麦改性淀粉取代度Fig. 4 Substitution degree of the wheat starches before and after surface gelatinization

3 结 论

小麦原淀粉主要由支链与直链淀粉组成，前者峰形较为尖锐，说明其相对分子质量较为集中；后者峰宽高但强度低，表明其是由一些不同聚合度的直链淀粉分子组成，聚合度呈连续分布。通过凝胶排阻色谱发现，表面糊化后剩余淀粉的蓝值及总糖含量明显下降，表明小麦淀粉经表面糊化处理后部分被移除或降解。通过测定其剩余淀粉颗粒中直链淀粉质量分数可知，随着表面糊化处理时间的延长，其直链淀粉质量分数随之降低；且剩余小麦A淀粉的直链淀粉质量分数要高于剩余小麦B淀粉的含量，证明随着颗粒大小的增加其直链淀粉质量分数增加。通过淀粉表面糊化处理前后的取代度测定结果可知，单一及复合改性的取代反应都主要发生在淀粉颗粒的表层，颗粒内部发生取代反应的概率较小。