肠膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85分子结构及对伤寒沙门氏菌的抗菌机理

高玉荣，李大鹏，张凤琴，宋俊梅

（巢湖学院化学与材料工程学院，安徽 合肥 238000）

随着人们对食品安全的日益重视，开发新型无毒的生物防腐剂成为食品工业的重要发展方向之一[1-2]。乳酸菌细菌素是由乳酸菌通过代谢作用产生的对其他微生物具有抑制或杀灭作用的多肽或蛋白质，是目前国内外公认安全的生物防腐剂[3-5]。目前广泛应用的乳酸菌细菌素是乳酸链球菌素，但由于其抗菌谱窄（只对部分革兰氏阳性细菌有抗菌作用，对革兰氏阴性细菌无抗菌作用），适用的pH值范围较窄，限制了其在食品中的应用[6-7]。因此新型广谱乳酸菌细菌素的研究和开发成为目前该领域的研究热点。

乳酸菌细菌素一般只对同属内或亲缘关系较近的菌株有抑制作用，目前乳酸菌细菌素的抗菌机理是以革兰氏阳性细菌为模式菌株，缺少对革兰氏阴性细菌抗菌机理的研究[8-12]；除了乳酸链球菌素外，对其他乳酸菌细菌素抗菌机理的研究并不系统，这使得新型广谱乳酸菌细菌素的开发及应用缺少理论支持。

国内外普遍应用于泡菜等蔬菜发酵中的肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides是公认安全的乳酸菌发酵剂[13]。目前国外已分离出少数产细菌素的Leuconostoc mesenteroides，如Héchard等[14]从羊奶中分离出一株Leuconostoc mesenteroides Y105，产生的细菌素mesentericin Y105分子质量为2.5～3.0 kDa；Maria等[15]从肉制品中筛选出一株Leuconostoc mesenteroides，产生的细菌素mesentericin B-TA33a分子质量为3.466 kDa。但目前发现的这些由Leuconostoc mesenteroides产生的细菌素只能抑制革兰氏阳性细菌的生长。

本课题组前期从传统发酵酸黄瓜中分离到一株产细菌素的肠膜明串珠菌Leuconstoc mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85，研究发现其产生的细菌素mesenterocin ZLG85是一种新型广谱的乳酸菌细菌素，不仅对革兰氏阳性细菌有抗菌作用，也对革兰氏阴性细菌具有较强的抗菌作用，具有作为新型生物防腐剂的应用前景[16-17]。本研究拟以前期实验发现的新型广谱的细菌素mesenterocin ZLG85为对象，通过液相色谱-质谱联用（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）、Edman降解法及圆二色光谱（circular dichroism，CD）对细菌素mesenterocin ZLG85的分子质量、氨基酸序列及二级结构进行解析，采用ProParam tool软件对细菌素的理化性质进行分析；以伤寒沙门氏菌为模式菌株，通过对紫外吸收物质渗漏、转膜电势及细胞膜通透性的影响来探讨细菌素mesenterocin ZLG85对伤寒沙门氏菌的抗菌机理，以期为新型广谱乳酸菌细菌素的研究和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

肠膜明串珠菌ZLG85分离自发酵酸黄瓜，美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）菌株编号为KF746910[16]。

伤寒沙门氏菌ATCC14028购买于中科院微生物研究所。

MRS培养基：鱼肉蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、柠檬酸铵2 g/L、三水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、结晶硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL、碳酸钙（粉）10 g/L、蒸馏水1 L，pH 6.5，121 ℃湿热灭菌20 min。固体培养基则在此基础上加入20 g/L的琼脂。

营养肉汤培养基：鱼肉蛋白胨20 g/L、酵母浸粉6 g/L、氯化钠5 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、蒸馏水1 L，pH 6.5，121 ℃湿热灭菌20 min。半固体（固体）培养基则在此基础上加入7.5 g/L（20 g/L）的琼脂。

1.2 仪器与设备

ABI 491型蛋白测序仪 美国应用生物系统公司；TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；LS55荧光分光光度计 美国PerkinElmer公司；EPICS-XL流式细胞仪 美国BD公司；J500型CD仪 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及液体培养

挑取肠膜明串珠菌ZLG85斜面保藏菌种1～2 环，接种于MRS固体斜面培养基上，30 ℃培养24 h。

挑取活化的斜面菌种1～2 环接种于装有50 mL MRS液体培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、100 r/min摇瓶培养24 h。

1.3.2 细菌素分离纯化

将肠膜明串珠菌ZLG85的培养液，按照Gao Yurong等[18]的方法进行细菌素的分离纯化，其中凝胶层析采用Sephadex G25进行，每步纯化后计算各步骤的总活力、比活力、蛋白质量浓度、产量和纯化倍数。其中：总活力（AU）是纯化后所获得样品中细菌素的抗菌活力，是溶液中每毫升抗菌活力（AU/mL）与体积（mL）的乘积；比活力是样品中每毫克蛋白所含的细菌素的活力单位，为一定体积纯化样品中抗菌活力（AU）与蛋白质量（mg）之比；蛋白质量浓度为1 mL细菌素样品中的蛋白质量（mg）。产量为纯化后的总活力与无细胞发酵液的总活力之比；纯化倍数为纯化后的细菌素样品的比活力与无细胞发酵液的比活力之比。

1.3.3 细菌素分子质量及结构分析

1.3.3.1 细菌素Tris-Tricine SDS-PAGE及LC-MS/MS分析

采用Tris-Tricine十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分离胶质量分数16.5%，浓缩胶质量分数5%。纯化的细菌素和低分子质量Marker同时在140 V电泳4 h。结束后，将胶切成两半，带有Marker的一半采用考马斯亮蓝染色脱色，另一半用无菌蒸馏水漂洗1 h后，小心地铺在接有指示菌的营养肉汤固体培养基上，30 ℃培养24 h后与染色的半块胶对比，找到具有抗菌活性的条带，即细菌素条带。将此条带转印在聚偏氟乙烯膜上，采用考马斯亮蓝染色。将切割的细菌素条带洗脱后进行LC-MS分析[19-20]。

1.3.3.2 细菌素氨基酸序列分析

将条带切割后，用ABI 491型蛋白测序仪对细菌素进行测序。采用Clustal Omega program将细菌素多肽序列与NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）数据库中的细菌素相比较[21]。

1.3.3.3 细菌素理化性质分析

使用ProParam tool（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）软件对细菌素的理化性质进行分析[22]。

1.3.3.4 细菌素CD分析

将细菌素溶于10 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中，细菌素浓度为100 μmol/L，采用J500型CD仪在室温下测定，扫描范围180～260 nm，样品池光径1 mm，CD数据以平均残基摩尔椭圆度（[θ]）表示，CD谱图为4 次累加的平均结果。以设备自带的软件对CD实测谱图进行平滑处理，使用Dichro Web（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）进行数据在线处理分析[23]。

1.3.4 细菌素抗菌机理分析

1.3.4.1 细菌素对伤寒沙门氏菌细胞生长的影响

收集培养至对数生长期的伤寒沙门氏菌细胞，用无菌水调整细胞悬浮液浓度为107CFU/mL，向其中加入制备的细菌素样品，使其终抗菌活力分别为40、80、160、320 AU/mL，30 ℃恒温静置培养16 h，以不添加细菌素的样品为空白对照，采用平板计数法测定伤寒沙门氏菌的活菌数[24]。

1.3.4.2 细菌素对紫外吸收物质渗漏的影响

将伤寒沙门氏菌的过夜培养物6 000×g离心15 min，收集菌体，细胞用无菌水洗涤两次，并重新悬浮在无菌水中，制成细胞悬浮液。在细胞悬浮液中添加纯化的细菌素mesenterocin ZLG85，使细菌素终抗菌活力为160 AU/mL，然后在36 ℃处理0、20、40、60、80 min和100 min。用0.22 μm的微孔滤膜过滤后，采用紫外-可见分光光度计分别在260 nm和280 nm波长处测定无细胞上清液的光密度值，以用蒸馏水处理的样品为空白对照。用处理一段时间后的上清液光密度值与初始光密度值的差值（ΔOD）来表示紫外吸收物质的渗漏程度[25]。

1.3.4.3 细菌素对转膜电势的影响

采用3,3’-二丙基-二碳菁碘化物（3,3’-dipropylthi adicarbocyanine iodide，DISC3(5)）作为检测转膜电势（Δφ）的荧光探针。离心收集伤寒沙门氏菌细胞，用磷酸盐-4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液（0.002 5 mol/L、pH 7.0）清洗，重新悬浮在相同的缓冲溶液中并添加0.1 m o l/L的葡萄糖。在细胞悬浮液中添加0.4 μmol/L的DISC3(5)混合后，分别添加0.1 μmol/L尼日利亚菌素、1 μmol/L缬氨霉素和终抗菌活力160 AU/mL的细菌素来测定细胞膜电势的变化。以不添加任何物质的细胞悬浮液作为空白对照，采用荧光分光光度计来测定荧光值，激发波长和发射波长分别设定为622 nm和670 nm[9]。

1.3.4.4 流式细胞仪测定细胞通透性

处于对数期的10 mL OD600nm为0.8～1.0的伤寒沙门氏菌，6 000×g离心15 min收集菌体，用pH 6.5无菌磷酸缓冲溶液清洗两次。用终抗菌活力160 AU/mL的mesenterocin ZLG85于37 ℃分别处理30 min和60 min后，6 000×g离心15 min收集菌体。以菌体悬浮在不含细菌素的纯净水中作为空白对照，以碘化丙啶（propidium iodide，PI）为染色剂，用流式细胞仪分析实验样品与对照样品的PI荧光强度[26]。

1.4 数据统计与分析

所有实验重复3 次，每次两个重复样品。采用SAS 8.1软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 细菌素分离纯化及Tris-Tricine SDS-PAGE分析结果

表1 细菌素mesenterocin ZLG85的纯化Table 1 Purification steps of mesenterocin ZLG85

由表1可以看出，最初的无细胞上清液经过乙醇抽提后，产量为90.2%，纯化倍数达到10.87，说明乙醇提取细菌素产量损失较小，且纯度有了较大的提高，适合细菌素的粗提。经过Sephadex G25凝胶层析，细菌素的损失较大，产量为57.8%，但纯化倍数有较大幅度提高，纯化倍数达25.37。经过Sp-FF快速流阳离子交换柱层析后，细菌素产量下降为42.6%，但纯化倍数提高到52.10，比活力提高到5 775.28 AU/mg，可达到细菌素纯化的要求。

从纯化后的Tris-Tricine SDS-PAGE（图1）分析可以看出，在2.5 kDa处出现明显单一蛋白条带，而且电泳后单一条带对指示菌有明显的抑制作用，形成了清晰的抑菌条带，表明了2.5 kDa的条带为抗菌肽，即mesenterocin ZLG85。

图1 细菌素mesenterocin ZLG85的Tris-Tricine SDS-PAGEFig. 1 Tris-Tricine sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis of mesenterocin ZLG85

2.2 细菌素结构分析结果

2.2.1 Mesenterocin ZLG85的LC-MS分析结果

图2 细菌素mesenterocinZLG85样品液相色谱图Fig. 2 Liquid chromatogram of mesenterocin ZLG85

图3 细菌素mesenterocin ZLG85质谱图Fig. 3 Mass spectrum of mesenterocin ZLG85

将细菌素mesenterocin ZLG85转膜纯化后进行了LC-MS分析，液相色谱图（图2）分析结果表明分离纯化后细菌素mesenterocin ZLG85的纯度为98.23%，质谱图（图3）结果表明细菌素mesenterocin ZLG85的准确分子质量为2 522.5 Da。

2.2.2 Mesenterocin ZLG85的氨基酸序列

采用Edman降解法，测定细菌素mesenterocin ZLG85的氨基酸序列为KYYGNGVGGCSGAKNNKGCWGWKS。从数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi中搜索，没有得到与mesenterocin ZLG85相同序列的细菌素。mesenterocin ZLG85与divercin V41（CAA11804.1）的同源性为57%；与enterocin CRL35（AAQ95741.1）的同源性为58%；与mesentericin Y105（AAB25127.1）和Chain A（1CW6_A）同源性为67%。采用Clustal Omega program（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行细菌素序列的同源性分析，结果见图4。由Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides ZLG85产生的细菌素mesenterocin ZLG85是一种新型广谱细菌素。

图4 采用Clustal Omega软件分析mesenterocinZLG85与其他细菌素的同源性Fig. 4 Alignment of amino acid sequences of mesenterocin ZLG85 with those of other reported bacteriocins using Clustal Omega program

2.2.3 Mesenterocin ZLG85的物理化学特性

在线软件ProParam tool分析结果表明，细菌素mesenterocin ZLG85的氨基酸数为24；理论分子质量为2 521.81 Da；理论pI值为9.51；负电荷残基总数为0，正电荷残基总数为4；原子总数为338；脂肪氨基酸指数16.25，总平均亲水性为－0.996；不稳定系数为16.47，根据多肽不稳定系数大于40则不稳定的标准可知该多肽是稳定的。

前期实验对细菌素mesenterocin ZLG85的稳定性进行研究的结果表明，细菌素mesenterocin ZLG85具有较强的稳定性，pH 2.0～10.0范围内，细菌素相对抗菌活性均在80%以上；121℃处理30 min后相对抗菌活性仍为93.77%。这与在线软件分析结果相同。预测分子质量（2 521.81 Da）与实际分子质量（2 522.5 Da）误差为0.28%，这些结果也说明在线软件ProParam tool进行细菌素的理化性质预测具有很高的准确性。

2.2.4 Mesenterocin ZLG85的 CD分析结果

图5 细菌素mesenterocin ZLG85的CD图Fig. 5 CD spectrogram of mesenterocin ZLG85

表2 细菌素mesenterocin ZLG85二级结构Table 2 Secondary structure composition of mesenterocin ZLG85

图5为用CD仪自带的软件进行平滑处理获得的CD图，表2为使用Dichro Web对数据进行在线分析得到细菌素mesenterocin ZLG85的二级结构相对含量。由图5和表2可以看出，细菌素mesenterocin ZLG85的二级结构主要为反平行结构、β-折叠和无规卷曲，分别为32.70%、20.70%和36.40%。

2.3 Mesenterocin ZLG85对伤寒沙门氏菌的抗菌机理

2.3.1 Mesenterocin ZLG85对伤寒沙门氏菌细胞生长的影响

图6 Mesenterocin ZLG85对伤寒沙门氏菌细胞生长的影响Fig. 6 Effect of mesenterocin ZLG85 on the growth of Salmonella typhi

由图6可以看出，不添加细菌素的伤寒沙门氏菌，随着培养时间的延长，活菌数显著增加。当细菌素mesenterocin ZLG85抗菌活力为40 AU/mL时，伤寒沙门氏菌活菌数没有显著增加（P＞0.05），起到了抑制伤寒沙门氏菌生长的作用；当细菌素抗菌活力为80 AU/mL时，处理20 h后伤寒沙门氏菌活菌数显著下降（P＜0.05），但下降值为1.6，致死率小于99%；当细菌素抗菌活力为160 AU/mL时，处理20 h后伤寒沙门氏菌活菌数显著下降（P＜0.05），下降值为4.1，致死率大于99.99%，结果表明160 AU/mL的细菌素对伤寒沙门氏菌表现为杀菌作用。

2.3.2 Mesenterocin ZLG85对紫外吸收物质渗漏的影响

图7 Mesenterocin ZLG85对伤寒沙门氏菌在260 nm and 280 nm波长处紫外吸收物质渗漏的影响Fig. 7 Effect of mesenterocin ZLG85 on the leakage of UV-absorbing materials at 260 and 280 nm from Salmonella typhi cells

核酸和蛋白质的最大吸收波长分别为260 nm和280 nm，因此常用这两个波长下的光密度值表征核酸和蛋白的浓度。由图7可以看出，当用mesenterocin ZLG85处理沙门氏菌40 min后，在260 nm和280 nm波长处的ΔOD值分别提高到0.469和0.495，而空白样品仅提高到0.018和0.034。结果表明mesenterocin ZLG85导致了大量260 nm和280 nm波长处紫外吸收物质的渗漏。

2.3.3 Mesenterocin ZLG85对Δφ的影响

图8 Mesenterocin ZLG85处理伤寒沙门氏菌后DISC3(5))荧光强度Fig. 8 Fluorescence absorption values of DISC3(5) in Salmonella typhi treated with mesenterocin ZLG85

采用荧光探针DISC3(5)来测定伤寒沙门氏菌的转膜电势Δφ。如果伤寒沙门氏菌细胞膜被破坏，将导致转膜电势Δφ的消散，使DISC3(5)释放到培养基中，引起培养液中荧光强度的提高。添加valinomycin引起伤寒沙门氏菌转膜电势Δφ的消散。但添加nigericin后，伤寒沙门氏菌细胞能维持转膜电势。在添加细菌素mesenterocin ZLG85 10 min后，引起了伤寒沙门氏菌转膜电势快速和完全的耗散，耗散速率与valinomycin相当。这些结果表明细菌素mesenterocin ZLG85引起了伤寒沙门氏菌细胞转膜电势的耗散。这种变化与Moll等[27]报道的II类细菌素plantaricins EF和plantaricins JK对Lactobacillus plantarum965的作用方式相似。

2.3.4 Mesenterocin ZLG85对细胞膜通透性的影响

PI能与DNA结合产生荧光，用PI染色细胞则染料能通过细胞膜进入细胞内与DNA结合。MnX是平均荧光道数，MnX越大，表明进入细胞的PI越多，与遗传物质DNA结合后荧光强度越大，细胞膜的损伤越大，细胞的通透性越高。由图9可以看出，与不用细菌素作用的对照样品相比，用160 AU/mL的细菌素mesenterocin ZLG85分别作用伤寒沙门氏菌30 min和60 min后，MnX从2.86分别提高到5.49和7.12。因此，用160 AU/mL的细菌素mesenterocin ZLG85作用沙门氏菌导致其细胞膜通透性的增大，形成了较大的孔隙。

图9 Mesenterocin ZLG85作用伤寒沙门氏菌流式细胞仪分析结果Fig. 9 Flow cytometry analysis of Salmonella typhi treated with mesenterocin ZLG85

3 讨 论

Mesenterocin ZLG85是从发酵黄瓜中分离出的肠膜明串珠菌Leuconstoc mesenteroides subsp.Mesenteroides ZLG85产生的细菌素，不仅能抑制革兰氏阳性细菌，也能抑制某些革兰氏阴性细菌，具有广谱的抗菌活性[16-17]。本研究首先对细菌素进行了分离纯化，并采用LC-MS测定其分子质量为2 522.5 Da；通过Edman降解法测定其氨基酸序列为KYYGNGVGGCSGAKNNKGCWGWKS。在数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi中未搜索到与之序列相同的细菌素，采用在线软件C l u s t a l Omega program（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行细菌素序列的同源性分析，结果表明肠膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85与mesentericin Y105（AAB25127.1）和Chain A（1CW6_A）的同源性最高，为67%，是一种新型细菌素。采用CD对肠膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85二级结构进行了解析，发现主要结构为反平行结构、β-折叠和无规卷曲。采用ProParam tool软件分析细菌素mesenterocin ZLG85的理论PI值为9.51，且具有稳定性。

此外，实验以伤寒沙门氏菌为模式菌株，采用紫外-可见分光光度计、荧光分光光度计和流式细胞仪，通过对紫外吸收物质渗漏、转膜电势及细胞膜通透性的影响探讨肠膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85对革兰氏阴性菌的抗菌机理。结果表明，肠膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85的主要作用部位是在目标菌的细胞膜上，其对伤寒沙门氏菌的抗菌机理是导致沙门氏菌在260 nm和280 nm波长处紫外吸收物质的大量渗漏和转膜电势Δφ的消散，并导致细胞膜通透性增大，形成孔洞，最终导致细胞死亡。肠膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85的这种作用机制与细菌素plantaricins EF和plantaricins JK[28]、bacteriocins ST194BZ和ST23LD[28]以及pentocin 31-1[29]对敏感菌的作用机制一致。

肠膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85不仅对革兰氏阳性细菌有抑菌作用，而且对革兰氏阴性细菌也有抑菌作用。细菌素作用的靶位点是细胞质膜，而革兰氏阴性菌的细胞外膜作为屏障阻止细菌素对细胞质膜发挥抑菌作用。实验结果表明肠膜明串珠菌素mesenterocin ZLG85最终也可作用于伤寒沙门氏菌的细胞膜，引起膜的穿孔作用。在线软件ProParam tool分析mesenterocin ZLG85是一种带正电荷的抗菌肽，对革兰氏阴性细菌的作用方式符合细胞膜损伤机理的假设[30]。细菌素mesenterocin ZLG85可能是通过静电作用，作用于革兰氏阴性细菌伤寒沙门氏菌细胞壁表面脂多糖的阴离子磷脂和磷酸基团，从而吸附到伤寒沙门氏菌细菌的表面，进而穿过细胞壁与细胞膜结合。Mesenterocin ZLG85疏水端可借助分子中连接结构的柔性插入到伤寒沙门氏菌的细胞膜中，并牵引其进入细胞膜，扰乱膜上脂质及蛋白质的排列秩序，多个细菌素聚合形成跨膜离子通道，导致大分子物质的流失，最终导致细胞死亡。