褐藻寡糖用于海水小球藻和盐生杜氏藻异养培养及其促生长作用机制❋

马冬冬， 李永富

(1. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 261000；2.中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室,山东 青岛 266071)

海水小球藻(Chlorellasp.)是河蟹幼体、轮虫和卤虫的理想饵料，在海洋水产养殖产业中发挥重要作用。盐生杜氏藻(Dunaliellasalina)繁殖迅速，对高温、高盐、强光等胁迫条件具有很强耐受能力，主要用作海参育苗饵料和生产β-胡萝卜素的原料[17]。本研究选取上述两种微藻为研究对象，考察酶解褐藻(海带)寡糖的生长促进作用，旨在为提高微藻生长速率，改进培养方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 藻种

Chlorellasp.和D.salina均取自中国海洋大学藻种库。用f/2培养基[18]对两种微藻进行预培养，其他条件为温度25 ℃、光照强度60 μmol·m-2·s-1，将微藻预培养至指数生长期备用。

1.2 海水

实验用天然清洁海水(pH=7.90±0.02、盐度32)取自青岛市石老人海域，经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤，并在121 °C条件下灭菌，冷却后备用。

1.3 海洋寡糖

褐藻寡糖(Alginate-derived oligosaccharide，ADO)由中国海洋大学食品科学与工程学院应用微生物实验室提供，是褐藻胶经Vibriosp. 510-64菌株产生专一性褐藻胶裂合酶酶解制备的寡糖片段。前期研究表明，ADO以二糖和三糖为主，分子量范围低于1 000[19]。

1.4 ADO对微藻生长影响实验设计

探究光照和黑暗两种培养方式下褐藻寡糖对两种微藻生长的影响。将预培养至指数生长期的微藻接种于含150 mL新鲜培养基的250 mL锥形瓶中，使每种微藻的初始接种密度为5×105cells·mL-1。按5%固液比用量添加ADO，即每瓶藻液中加入7.5 mg(50 mg·L-1)，以不加ADO的微藻为对照组(Control)，不接入微藻但添加ADO的处理为空白组(Blank)，Control和光照处理组(Sample-light)在培养箱中光强60 μmol·m-2·s-1下培养；黑暗处理组(Sample-dark)用黑色硬纸板营造无光条件，其他条件同Sample-light组。各组均设3个平行，分别培养8 d，每隔2 d测定藻液750 nm处吸光度(A750)，培养第4天测定藻液色素含量。

1.5 光合色素含量及比生长速率测定

取5 mL待测藻液，于2 500×g下离心15 min。除去上清液后加入5 mL 90%丙酮，摇匀后于完全黑暗条件下提取24 h。将提取液于2 500×g下离心15 min，上清液即为色素提取液。分别于470、647和664 nm处测定吸光度。叶绿素a(Chla)和叶绿素b(Chlb)按式(1)～(2)计算[20]，类胡萝卜素(Car)按式(3)计算[21]：

Chla=11.93 OD664-1.93 OD647；

(1)

Chlb=20.36 OD647- 5.50 OD664；

(2)

(3)

微藻指数生长期比生长速率(μ)按下式计算：

(4)

式中N1、N2分别为t1和t2时刻微藻光密度。

1.6 呼吸耗氧速率和光合放氧速率测定

参考文献[22]的方法，室温下用Chlorolab-2型液相氧电极 (英国Hansatech公司)测定：使用零点校正法，进行电极校正，即向液相体系中加入连二亚硫酸钠设定氧电极零点基线，将反应室清洗干净。向其中加入1.5 mL藻液，开启搅拌器并保持转子转速80 r/min，开始测定，首先营造无光环境持续20 min，以溶解氧浓度下降速率表示暗呼吸耗氧速率(Rd)；之后开启光源，在60 μmol·m-2·s-1光强下测定氧信号至稳定增长或降低，截取此时的变化速率即为净光合作用放氧速率(PNet)，总光合作用速率PGross=Rd+| PNet|。

1.7 叶绿素荧光参数测定方法

采用 FMS-2 便携式调制式荧光仪(Hansatech, 英国) 参考文献[24]的方法测定：将1.5 mL待测藻液放入荧光测定样品瓶，暗处理15 min 后，测定Fo, 用饱和脉冲光(8 000 μmol·m-2·s-1)照射 0.7 s 测得Fm。300 μmol·m-2·s-1作用光下照射藻液 120 s，及时记录荧光Ft，Ft稳定时的荧光为F′s，然后打开饱和脉冲光(8 000 μmol·m-2·s-1) 照射 0.7 s，测定F′m，关闭作用光，同时打开远红光照射 3 s，测得F′o。 以不加寡糖的微藻为对照，以过滤灭菌海水为空白。PSII 最大光化学效率Fv/Fm和光化学淬灭系数qP按下式计算：

(5)

(6)

1.8 数据处理

使用SPSS16.0软件对数据进行单因素方差分析和显著性差异检验(p<0.05)。

2 研究结果

2.1 ADO对两种微藻生长和色素含量的影响

ADO对两种微藻生长的影响见图1。培养阶段Blank组吸光度均不变，说明纯ADO加入对培养体系本底吸光度值无影响，各实验组A750变化由微藻细胞吸收引起。光照条件下，ADO的加入显著促进了两种微藻的生长。对于Chlorellasp.，培养第4天时微藻光密度达到最大值，为对照组的2.2倍，之后迅速进入平台期。Sample-light组Chlorellasp.指数生长期比生长速率可达0.192 d-1，远高于Control组的0.081 d-1和Sample-dark组的0.074 d-1。可见ADO明显提高了Chlorellasp.的生长速率并缩短了培养周期。对于D.salina，Sample-light组指数生长期的比生长速率为0.259 d-1，高于Control组的0.139 d-1和Sample-dark组的0.204 d-1。值得注意的是，两种微藻的Sample-dark组均出现A750增长，比生长速率分别为0.074和0.204 d-1，说明无光条件下Chlorellasp.和D.salina均能依赖ADO维持细胞增殖。

图1 ADO加入后不同培养方式下海水小球藻(A)和盐生杜氏藻(B)的生长曲线(n=3)Fig. 1 Growth curves of Chlorella sp. (A), D. salina (B) under different cultural modes with 50 mg·L-1 ADO added in suspension (n=3)

不同培养方式下的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量变化见图2。对于Chlorellasp.，虽然生长影响试验表明光照下ADO的加入促进了微藻生长，但与对照组相比，Chla和Car的含量均有显著降低(p<0.05)，Chlb则未有明显变化。与Chlorellasp.相反，光照下ADO的加入明显促进了D.salina中Chla、Chlb和Car的含量。

图2 添加ADO对海水小球藻和盐生杜氏藻色素含量的影响(n=3)Fig. 2 Effect of ADO on the Chl a, Chl b, and Car concentrations of Chlorella sp. and D. salina, respectively (n=3)

2.2 ADO对微藻呼吸耗氧速率和光合放氧速率的影响

对于Chlorellasp.，光照和黑暗条件下寡糖的添加均促进了呼吸作用，表现为Sample-light组和Sample-dark组的Rd均高于Control组。而光下PGross与Control组无显著性差异甚至略有降低(见图3(A))。D.salina中Rd的变化规律与Chlorellasp.类似，无论在光照或黑暗下，寡糖均能促进使Rd提高；但是，Samplelight组PGross明显高于Control组(见图3(B))。

图3 添加ADO对海水小球藻(A)和盐生杜氏藻(B)光合速率与呼吸速率的影响(n=3)Fig. 3 Effect of ADO on the Photosynthetic rate and respiratory rate of Chlorella sp. (A) and D. salina (B), respectively (n=3)

2.3 寡糖作用下微藻的叶绿素荧光分析

叶绿素荧光分析技术能够快速灵敏的反映微藻细胞内部生理状态，可反映环境因子对光合作用过程的影响[27]。各参数中，Fv/Fm是经过充分暗适应的生物样品PSII最大光能转化效率指标，qP表示总PSII反应中心中开放的反应中心所占的比例。ADO对两种微藻叶绿素荧光参数的影响见表1。单因子方差分析结果表明，ADO添加显著提高了D.salina的Fv/Fm和qP，而未对Chlorellasp.的荧光参数造成显著影响(P<0.05)。

表1 褐藻寡糖对两种微藻叶绿素荧光参数的影响(n=4)Table 1 Effect of alginate oligosaccharide to photosynthetic parameters of two microalgae (n=4)

3 讨论

当前，异养化技术成为微藻培养研究的热点，且已进入了一个从单纯的实验室培养研究到大批量产业化生产应用的阶段。但是，海水藻株可异养培养的不多见，仅有寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、小环藻(Cyclotellasp.)、平滑菱形藻(Nitzschialaevis)、绿球藻(Chlorococcumsp.)、亚心形扁藻(Platymonassubcordiformis)、四爿藻(Tetraselmissuecica)以及球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)等少数几株的报道[23-27]。一般认为，微藻不能异养的可能原因：一是通透性障碍，即有机物难以透过细胞膜进入细胞或者缺乏浓缩有机物的能力而不能被异养；二是缺乏与有机物分解代谢相关的酶；三是限制性的呼吸能力。在异养条件下，某些微藻虽然能利用有机物，但能力非常微弱，使得呼吸作用所提供的能量不足以维持其生长[28]。孙俊楠等[29]发现，添加葡萄糖可促进D.salina生长。本研究中发现了ADO可作为有机碳源供两株微藻利用，说明该物质有助于突破海水藻难以异养培养的生物学屏障，可为Chlorellasp.和D.salina提供新的有机碳源。在Yokose等的研究中，20 g·L-1的寡糖加入量可将拟眼点微绿球藻的生长速率提高5倍[15]，但用量远大于本研究的50 mg·L-1；Yamasaki等对莱茵衣藻生长促进作用研究中的褐藻寡糖用量也高达1 000 mg·L-1 [16]。本研究表明，相对极低量的褐藻寡糖即可明显促进Chlorellasp.和D.salina生长。从生长促进和用量两方面考虑，褐藻寡糖用于Chlorellasp.和D.salina异养培养更有应用潜力。

添加褐藻寡糖对两种微藻呼吸作用均有提升作用。黑暗中，两株藻均维持较高的呼吸速率，这一现象说明褐藻寡糖作为呼吸作用底物参与了Chlorellasp.和D.salina的代谢过程。与呼吸耗氧速率不同，光照条件下寡糖的加入未能促进Chlorellasp.的光合放氧速率。呼吸耗氧速率和光合放氧速率的测定结果表明，ADO不能促进Chlorellasp.的光合作用，其促进Chlorellasp.的生长主要通过提高异养作用实现。与Chlorellasp.不同，光照条件下D.salina寡糖添加的试验组光合放氧速率明显提高，表明褐藻寡糖促进了D.salina的光合作用，这与色素和叶绿素荧光参数的测定结果一致，原因可能是ADO通过促进呼吸作用提高了色素合成所需的能量[30]或可溶性糖参与色素合成相关酶编码基因表达的分子调控[31]。前人研究发现，高等植物果实果皮中可溶性糖的代谢、转化酶活性变化和果皮的转红发生在同一时期，可见可溶性糖与花青素的合成有着密切的联系[32]。但ADO对微藻色素的影响是通过糖酵解途径还是调控基因表达尚不清楚，需要更多研究。

4 结论

(1)褐藻寡糖可作为有机碳源显著提高Chlorellasp.和D.salina在光下的生长速率。黑暗条件下，两种微藻均可依赖褐藻寡糖实现完全异养培养。光照条件下，添加褐藻寡糖的D.salina叶绿素含量、光合放氧速率以及光化学效率均有显著提高，但Chlorellasp.光合放氧速率未发生显著变化，且色素含量降低。

(2)褐藻寡糖对两种微藻的生长促进作用机制不同，促进Chlorellasp.的生长主要通过异养同化作用；对于D.salina，除异养同化作用外，褐藻寡糖还可以通过促进光合作用促进其生长。