濮阳市涂阴肺结核患者采用利福平耐药实时荧光定量核酸扩增联合T-SPOT.TB检测的应用效果

王明远，赵顺现

（濮阳市第五人民医院结核病科,河南 濮阳457000）

我国属世界上结核病高负担国家之一,据统计,我国结核病患病人数仅次于印度，高居全球第2位，防治形势非常严峻[1]。以往临床多通过从患者体液、血液、分泌物中分离出结核分支杆菌来诊断结核病，检测方法包括分离培养法及涂片显微镜检查法，其中分离培养法诊断灵敏度较高，但耗时较长；而涂片法诊断灵敏度较低，仅为30%~50%[2]。因此，既往结核病诊断方法已无法满足临床早期确诊结核病的需要。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术属全自动分子诊断方法之一，此项技术是基于结核杆菌核酸扩增为基础,故可有效提高对结核病的诊断灵敏度[3]。近些年,T-SPOT.TB开始逐渐被应用于临床检测,使涂阴肺结核等结核病诊断取得较大突破。T-SPOT.TB是通过检测外周血中特异性T淋巴细胞来明确结核分支杆菌感染的检测方法，此种检测方法诊断敏感性较高，尤其适用于结核病诊断，尤其对免疫功能低下患者具有较高敏感性,在目前临床各类结核病诊断中备受关注[4]。本文选取涂阴肺结核患者126例,旨在探究濮阳市涂阴肺结核患者采用利福平耐药实时荧光定量核酸扩增联合T-SPOT.TB检测的应用效果，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我市2015年3月-2017年12月涂阴肺结核患者126例设为研究组,均经影像学检查确诊，排除免疫缺陷患者，其中女52例，男74例，年龄 21～82 岁，平均（55.47±10.23）岁；另选同期结核潜伏感染患者121例设为对照组,结核菌素试验均呈阳性，胸部X线片检测正常，具有结核病接触史，排除免疫缺陷患者，其中女49例，男72例，年龄 22～83 岁，平均（54.68±9.41）岁，2 组临床资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT.TB 采集静脉血4 ml,置于真空采血管，迅速将其混匀，于2 h内分离出外周血单个核细胞；以T-SPOT.TB试剂盒（购于上海逸峰生物科技有限公司）检测结核菌致敏T细胞，且依据试剂盒上面说明进行各项操作,以显微镜观察阴性斑点数,记录所检出的具有结核特异抗原致敏效应的细胞数目。

1.2.2 利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测 采集患者痰液进行培养，培养基购于珠海贝索公司，以4%氢氧化钠溶液进行分离培养，将痰标本置于处理管中，加入4%氢氧化钠溶液且充分混匀，静置15 min后以处理液均匀接种于培养基斜面上，观察且记录培养情况；检测仪器购于美国Cepheid公司，取1 ml痰标本与2 ml处理液并混匀，于涡旋震荡器上震荡25 s，静置15 min后，取混合液2 ml置于一次性多室塑料反应盒中,将反应盒置于检测模块中，进行自动化分析，2~3 h后读取结果。

1.3 观察指标 ⑴统计利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测与T-SPOT.TB单一检测及联合检测涂阴肺结核的结果;⑵比较利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测与T-SPOT.TB单一检测及联合检测涂阴肺结核的诊断效能。

1.4 统计学分析 以SPSS 23.0处理，计数资料（诊断特异度、诊断灵敏度、诊断准确度、阴性预测值、阳性预测值、误诊率、漏诊率）以n（%）表示、卡方检验，检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 单一检测及联合检测涂阴肺结核的结果 经利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测确诊涂阴肺结核真阳性71例，经T细胞酶联免疫斑点试验检测确诊涂阴肺结核真阳性73例，经联合检测确诊涂阴肺结核真阳性109例，见表1。

表1 单一检测及联合检测涂阴肺结核的结果

2.2 单一检测及联合检测涂阴肺结核的诊断效能利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测与TSPOT.TB联合检测涂阴肺结核诊断特异度为97.52%、诊断灵敏度为86.51%、诊断准确度为91.90%、阴性预测值87.41%、阳性预测值97.32%均较单一检测高，误诊率2.48%、漏诊率13.49%均较单一检测低，约登指数较单一检测高（P＜0.05），见表2。

表2 单一检测及联合检测涂阴肺结核的诊断效能n（%）

3 讨论

目前，在全球公共卫生问题中，肺结核属病死率最高传染性疾病之一,且近些年随全球人口老龄化情况日益加剧，肺结核发病率亦不断攀升，极大影响患者身心健康及生活质量[5-7]。目前，肺结核实验室常规检测方法为痰涂片,此种方法检测时间较短，费用相对低廉，但诊断敏感性较低，尤其对标本含菌量要求较高，易造成涂阴肺结核患者漏诊。痰培养结核杆菌亦为涂阴肺结核诊断常用方法，但此种方法检测周期较长，诊断敏感性亦较低，且对实验室生物安全性要求较高,使其推广受到极大限制。涂阴肺结核患者若不能及时确诊，则会导致丧失最佳治疗时机，致使其病情恶化发展，甚至危及其生命安全。因此，探寻一种早期发现及精准迅速诊断涂阴肺结核方法，具有重要临床意义。

利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术是集标本处理、利福平耐药基因rpoB突变检测、结核杆菌特异核酸检测、DNA提取、核酸扩增为一体的结核病快速诊断方法，检测过程仅需1.5 h，且可同时进行利福平耐药及结核分支杆菌检测。此项技术被应用于儿童结核病、纵隔淋巴结核、脊柱结核、结核性淋巴炎、结核性脑膜炎及结核性胸膜炎等疾病诊断,均表现出较高的灵敏度及特异度[8,9]。Moure R等[10]学者研究表明，采取利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测涂片阴性培养的肺外结核标本，诊断灵敏度为58.30%。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测对无菌体液标本检测敏感性较低，如对胸腔积液检测敏感性仅为26.90%，但对非液体标本检测敏感性较高,如对脓肿穿刺物检测敏感性为76.50%[11]。Vadwai V等[12]学者研究报道，采取利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测肺外结核，诊断敏感性为80.57%。

当机体感染结核分支杆菌时,体内将产生及分泌结核相关性记忆T淋巴细胞,若二次遭受结核相关性抗原刺激时，则可转化为效应T淋巴细胞，从而分泌IFN-γ，CFP-10及ESAT-6属结核分支杆菌基因RD1区域rv3874及rv3875编码的结核相关性蛋白抗原，能从结核感染患者T细胞中，介导产生较强IFN-γ释放反应,依据上述原理设计产生的T-SPOT.TB技术逐渐成为目前临床检测结核病最主要诊断方法。近些年，T-SPOT.TB被广泛应用于艾滋病伴发结核、儿童结核病、肺外结核、活动性结核病、结核感染等疾病的辅助诊断，均获得良好效果[13,14]。文献表明，T-SPOT.TB检测活动性结核病的诊断敏感性为53%～96%，诊断特异性为60%～85%[15]。但T-SPOT.TB检测技术亦存在不足，如不能有效鉴别活动性结核病与结核潜伏感染,在结核潜伏感染高发地区可能会导致诊断特异性偏低，因此不能仅凭T-SPOT.TB来诊断涂阴肺结核。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测与T-SPOT.TB联合检测涂阴肺结核患者,能互相弥补彼此的不足，进而显著提高诊断准确率。本文可知，联合检测涂阴肺结核诊断特异度为97.52%、诊断灵敏度为86.51%、诊断准确度为91.90%、阴性预测值87.41%、阳性预测值97.32%高于单一检测，误诊率2.48%、漏诊率13.49%低于单一检测，约登指数较单一检测高（P＜0.05）。可见，利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测与T-SPOT.TB联合检测涂阴肺结核患者，能有效提高诊断特异度、诊断灵敏度及诊断准确率，降低误诊率及漏诊率，且能为临床拟定治疗方案提供依据。

综上,利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测与T-SPOT.TB联合检测,可显著提高涂阴肺结核患者的诊断效能,有助于涂阴肺结核患者早期诊断及临床控制。