TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 表达水平变化与甲状腺结节患病的关系

尹洪涛 ，古君 ，郭向阳 ，李英昭 ，陈秋

(1.信阳市中心医院，河南 信阳 464000；2.信阳市淮滨县卫生学校，河南 信阳 464400；3.成都中医药大学附属医院)

甲状腺结节与甲状腺乳头状癌的鉴别诊断对临床上治疗方案的确定及治疗效果和预后具有重要作用[1]。目前较多的研究报道已经明确VEGF、MMP-9等在甲状腺乳头状癌组织中较高的染色阳性率[2]。TFF3是呈三叶草结构的小分子多肽，有研究报道其含量与乳腺癌、食管癌等肿瘤的发生发展关系密切，较少的报道其与甲状腺乳头状癌的关系[3]。TPX2是被证实的与肿瘤的发生发展、凋亡、周期等密切相关的微管相关蛋白，可反映肿瘤的增殖能力、分化能力，凋亡失衡，抑制肿瘤细胞的凋亡通路，促进肿瘤细胞的增殖分化[4]。WIP1是具有丝/苏氨酸活性的磷酸蛋白酶[5]。有研究报道[6]其浓度与乳腺癌、神经母细胞瘤的发生发展有关，很少报道其水平变化与不同类型甲状腺结节的相关性。本文检测 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 在不同类型甲状腺结节中的表达情况,并比较表达的阳性率与肿瘤大小、是否发生淋巴结转移等临床特征的相关性。旨在为甲状腺结节及甲状腺乳头状癌的鉴别诊断提供科学依据。现报告如下。

1.1 一般资料 随机选取2016年1月－2017年1月我院甲状腺手术切除标本306例,经病理证实分类，结节性甲状腺肿56例、甲状腺腺瘤95例、乳头状癌79例、滤泡癌41例、髓样癌15例、未分化癌20例，患者中男性104例，女性202例，年龄为26岁～75岁，平均年龄为(45.56±9.12)岁；甲状腺恶性肿瘤经术后病理学检查，肿瘤直径≥2.0cm者78例，肿瘤直径＜2.0cm者77例，发生淋巴结转移者57例，未发生淋巴结转移者98例。纳入标准：患者临床资料完整；术前未接受放化疗；患者及家属知情同意,均签署知情同意书且经本院伦理委员会批准。排除标准：伴有心、肝、肾等主要脏器功能不全；伴有其他部位恶性肿瘤者；妊娠期和哺乳期妇女；伴有免疫系统疾病。

1.2 检测指标 取术后切除的甲状腺结节组织，大小约为0.5cm×0.5cm×0.5cm,常规制作石蜡切片，采用免疫组化 SP 法检测 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白表达。

1.3 检测方法 采用石蜡进行连续性切片，脱蜡至水后采用H2O2室温下孵育10min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5min，8%的蛋白粉封闭液（商品名：BSA购自南京博奥生物科技公司），封闭2h，倒去封闭液后加入一抗(兔来源 浓度1：1000～1500)，4℃冰箱过夜,磷酸盐缓冲液冲洗3次,每次3～5min,加入二抗(鼠来源浓度 1：400～500),室温孵育20～30min,磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5min，加入辣根酶或碱性磷酸酶的标记物，室温孵育10min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5min，滴加显色剂（DAB购自南京博奥生物科技公司），复染，脱水，封片。

1.4判定标准 以细胞膜内出现棕黄色的颗粒为阳性染色,综合阳性细胞数占瘤细胞比例和着色强度进行半定量判定。 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白表达着色强度判定标准：不着色为0分；浅黄色为1分；黄棕色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞数占瘤细胞比例判断标准：选择5～10个高倍视野,计算1000个肿瘤细胞中阳性细胞的百分率，阳性细胞数<5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。2种评分相加，最终结果 0～1 分为阴性(-)；2 分为阳性(+)；3～4 分为强阳性(++)；5～7 分为极强阳性(+++)。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件，各类甲状腺结节、不同直径癌组织、是否发生淋巴结转移,癌组织间各蛋白表达强度比较采用Wileoxon秩和检验,组间各蛋白弱表达与强表达组织数量比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 甲状腺结节组织TFF3蛋白表达 表1、表2结果显示：在甲状腺肿组织中，TFF3蛋白表达弱，在甲状腺腺瘤组织中呈中等强度表达,而在甲状腺癌组织中阳性至强阳性表达率高达80.65%，三组表达强度分布有显著性差异（P<0.01）。在甲状腺癌组织中，肿瘤直径＞2cm组TFF3蛋白表达强于≤2cm组，发生淋巴转移患者癌组织TFF3蛋白表达强于未发生淋巴转移患者癌组织,差异均有显著性（P<0.01）。

表1 各类甲状腺结节组织TFF3蛋白表达比较

表2 不同类型甲状腺癌组织TFF3蛋白表达比较

表3 各类甲状腺结节组织TPX2蛋白的表达比较

表4 不同类型甲状腺癌组织TPX2蛋白表达比较

表5 各类甲状腺结节组织WIP1蛋白的表达比较

2.2 甲状腺结节组织TPX2蛋白表达 表3、表4结果显示：不同性质的甲状腺结节组织TPX2蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义（P<0.01）。临床因素分析表明，TPX2蛋白表达与甲状腺癌肿瘤大小及有无淋巴结转移均有相关性（P<0.01）。

2.3 甲状腺结节组织WIP1蛋白表达 表5、表6结果显示：不同性质的甲状腺结节组织WIP1蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义（P<0.01）。临床因素分析表明，WIP1蛋白表达仅与甲状腺癌肿瘤大小有关（P<0.01），而与有无淋巴结转移均无关。

2.4 甲状腺结节组织Ang2蛋白表达 表7、表8结果显示：不同性质的甲状腺结节组织Ang2蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义（P<0.01）。临床因素分析表明，Ang2蛋白表达仅与甲状腺癌肿瘤大小有关（P<0.01），而与有无淋巴结转移均无关。

表6 不同类型甲状腺癌组织WIP1蛋白表达比较

表7 各类甲状腺结节组织Ang2蛋白的表达比较

表8 不同类型甲状腺癌组织Ang2蛋白表达比较

3 讨论

目前，已经有报道证明［7］MMP-9、VEGF 与肿瘤的转移、侵袭有密切联系，并有报道证实[8]MMP－9、VEGF在甲状腺乳头状癌组织中高表达。张寅等[9]通过免疫组织化学法发现甲状腺乳头状癌患者组织中PCNA具有较高的染色阳性率。研究能生物标志物以鉴别诊断甲状腺肿瘤的良性与否对治疗方案的确定及预后至关重要。

TFF3是哺乳动物TFF家族中三个成员之一，呈三叶草形态的小分子多肽。可抑制黏膜凋亡，具有黏膜保护和修复作用。促进肿瘤扩散。有报道证实其水平变化与乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤的发生发展关系密切[10]。 吴靖芳等报道［11］TFF3在甲状腺乳头状癌患者与甲状腺乳头状腺瘤中表达水平具有显著差异。PTC组织中TFF3蛋白、mRNA阳性表达率高于腺瘤、良性肿瘤伴增生。且其含量与肿瘤分期有关，董猛等［12］报道，III/IV期甲状腺乳头状肿瘤患者TFF3表达水平高于I/II期患者,本研究结果显示 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白在甲状腺肿、甲状腺瘤和甲状腺癌三组间表达强度均有显著差异（P<0.01）。TFF3、TPX2蛋白表达与肿瘤大小和淋巴结转移有关（P<0.01）,与陈勇华等报道一致［13］。说明，TFF3可作为甲状腺结节与甲状腺乳头状癌的鉴别诊断依据，且能评估临床分期，细化诊断结果。TPX2是微管相关蛋白，在有丝分裂尤其是纺锤体形成过程中作用显著。刘世强等报道［14］TPX2表达水平与胃癌、食管癌等表达密切相关。TPX2异常表达，可导致中心体异常扩增，异倍体形成，细胞恶性转化发生，促进细胞增殖，与肿瘤细胞的周期、凋亡、分化、转移、复发密切相关。本文显示 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白在甲状腺肿、甲状腺瘤和甲状腺癌三组间表达强度均有显著差异（P<0.01）。提示，TPX2标志甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力,反映细胞分化和凋亡失衡状态,促进肿瘤发生发现。TPX2可使肿瘤凋亡通路抑制，肿瘤细胞凋亡受阻。WIP1是具有丝/苏氨酸活性的蛋白磷酸酶，有研究报道其与乳腺癌、神经母细胞瘤的发生发展有关。Joe Y等［15］利用免疫组化法和PCR扩增技术发现,甲状腺乳头状癌组织及正常甲状腺组织高表达共济失调-毛细血管扩张突变基因chk2，其磷酸化组织肿瘤发生，甲状腺乳头状癌组织中高表达的WIP1与chk2结合,去磷酸化,促进肿瘤发生发展。本文显示TFF3、TPX2、WI P1、Ang2蛋白在甲状腺肿、甲状腺瘤和甲状腺癌三组间表达强度均有显著差异（P<0.01）。提示，WIP1在甲状腺癌细胞增殖、凋亡、周期中起重要作用,在甲状腺乳头状癌患者组织中高表达。肿瘤的发生发展、转移复发与新生血管的形成密不可分。新生血管的形成不仅为肿瘤的生长提供营养,并且新生血管壁薄弱，基底膜不完整，为肿瘤的侵袭和转移提供条件。Ang包含Ang1、Ang2、Ang3、Ang4四个成员,其中前两种与新生血管的形成关系密切。Ang2作为一种分泌型糖蛋白,常以同源二聚体形式存在，是肿瘤诱导新生血管形成的早期标志。本文显示：TFF3、TPX2、WIP1、Ang2蛋白在甲状腺肿、甲状腺瘤和甲状腺癌三组间表达强度均有显著差异 （P＜0.01）。且WIP1、Ang2蛋白表达仅与肿瘤大小有关 （P＜0.01），而与淋巴结转移无关（P＞0.05）。 说明，Ang2表达水平在甲状腺乳头状癌与甲状腺结节患者表达差异显著，前者显著高于后者，可作为鉴别诊断的依据。

综上所述 TFF3、TPX2、WIP1、Ang2 蛋白的免疫组化检测有助于判别甲状腺结节性质。旨在为甲状腺结节的临床鉴别诊断提供科学依据。