hsa-miR-144在结核性胸膜肥厚患者外周血中的表达及其与炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6的关系

焦淑静，王红坡

（1.商丘市第三人民医院检验科，河南 商丘476000；2.新乡医学院第一附属医院磁共振科，河南 卫辉 453100）

结核性胸膜炎属于结核分枝杆菌感染累及胸膜的一种炎症疾病，发热、胸痛、乏力、呼吸困难等是此病的常见临床症状[1]。结核性胸腔积液中的纤维蛋白容易沉着在人体胸膜表面,产生积液包裹以及形成胸膜肥厚,进而发生限制性通气障碍[2]。为此,在治疗结核性胸膜炎疾病过程中应注重胸膜炎性反应的抑制、抑制胸膜增厚。miRNAs属于近年来新发现的内源性非编码小RNA,研究证实[3,4]其表达失调与肿瘤疾病、炎症疾病的发生发展相关。目前,有关hsa-miR-144在结核性胸膜肥厚患者中的研究报道尚少。结核病和免疫紧密相关，研究证实[5]Thl细胞分泌出来的γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素 6(IL-6)等细胞因子参与了结核病患者的免疫病理过程。因此我们采用RT-PCR法检测结核性胸膜肥厚患者外周血中hsa-miR-144的表达并分析其与血浆中炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6 的相关性,以进一步探讨其在结核性胸膜肥厚发病中的作用,为临床诊治此病提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年1月-2018年3月河南省商丘市第三人民医院80例临床诊断结核性胸膜肥厚患者的外周血标本，其中男50例，女30例，年龄 21～65 岁，平均(41.3±2.4)岁；临床表现：咳嗽、咳痰45例，胸疼25例，发热伴胸疼10例；胸腔积液量 940～2830 ml，平均(2316.7±54.8)ml；发病至入院就诊时间 1～10 d，平均(5.1±1.6)d；单纯性结核性胸膜炎60例，肺结核合并结核性胸膜炎20例。入选标准：均经胸膜活检病理确诊或痰涂片抗酸染色阳性者；经胸部螺旋CT检查显示胸膜肥厚者[6]。排除标准：存在活动性肺内病变者；心、肝、肾及肺功能异常者；有神经系统疾病及代谢性疾病者；存在免疫缺陷病者;孕妇或哺乳期妇女；药物过敏者;对胸腔穿刺引流术不可耐受者。另收集80例健康对照者的外周血标本，其中男48例，女32例；年龄 22～64 岁，平均(40.8±2.1)岁。

1.2 仪器和试剂 Ficoll淋巴细胞分离液购自北京中西远大科技有限公司；Trizol试剂购自上海生工生物工程技术服务公司；Taqman miRNAs反转录试剂盒、Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser均购自上海捷瑞生物工程有限公司；SYBRRPremix Ex TaqTM购自北京宝日医生物技术有限公司。 IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司。实时荧光定量PCR仪购自上海宏石医疗科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本收集及处理 空腹采集研究对象的静脉血5ml于肝素钠抗凝管中，混匀备用。运用常规方法使用Ficoll淋巴细胞分离液提取PBMC。

1.3.2 hsa-miR-144的检测 依据Trizol试剂说明书提取研究对象的PBMC总RNA，测定总RNA浓度及质量。运用SYBR法实施RT-PCR检测，引物由北京密码子生物科技有限公司设计及合成。采用Taqman miRNAs反转录试剂盒和miRNAs特异性茎环结构（stem-loop）反转录引物进行反转录反应。反转录条件：16℃孵育 2 min，42℃反应 1 min，50℃反应 1 s，40个循环，再 85℃孵育 5 min，4℃终止反应。预扩增反应条件：95℃ 10 min，55℃、72℃分别反应 2 min，95℃ 15 s，60 ℃40 min，12个循环，99.9℃孵育10 min。漩涡混匀TaqMan®通用PCR预混PCR反应液。hsa-miR-144荧光定量PCR引物。PCR反应条件：94.5℃反应 10 min，97 ℃ 30 s，59.7 ℃ 1 min，40 个循环反应。内参U6引物序列 ：上游引物5'-GCGCGTCG TGAAGCGTTC-3'，下游引物 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。hsa-miR-144引物序列：上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTCCCAGGA-3',下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TCAGTTGAGAGGGATTC-3'。以2-△△Ct表示结核性胸膜肥厚患者PBMC中目的基因的表达相对和健康对照者的变化倍数。

1.3.3 血浆炎性因子的检测 应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定研究对象血浆炎性因子γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素 6(IL-6)表达水平。具体步骤依据IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒的说明书操作。正常值范围：IFN-γ 为 0～20 ng/L,TNF-α 为 0～60 ng/L，IL-6 为0～40ng/L。

1.4 统计学处理 实验数据采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。符合正态分布定量资料的统计描述,采用均数±标准差(x±s)表示，两样本均数比较用t检验，hsa-miR-144与血浆炎性因子的相互关系采用spearman检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核性胸膜肥厚患者与健康对照者PBMC中hsa-miR-144表达水平比较 通过RT-PCR法测定80例结核性胸膜肥厚患者与80例健康对照者PBMC中hsa-miR-144的表达差异。结核性胸膜肥厚组PBMC中的hsa-miR-14 4水平明显高于健康对照组（P＜0.01），见图 1。

2.2 结核性胸膜肥厚患者与健康对照者血浆炎性因子水平比较 ELISA法检测结果显示，结核性胸膜肥厚组血浆炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6分别为（47.16±4.08）ng/L、（72.83±3.22）ng/L、（61.97±5.1 1）ng/L，均明显高于健康对照组（P＜0.05），见表 1。

图1 RT-PCR法检测PBMC中hsa-miR-144的相对表达量

表1 ELISA法检测血浆炎性因子水平比较

2.3 相关性分析 spearman相关性分析显示，结核性胸膜肥厚患者外周血PBMC中hsa-miR-144与血浆炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6水平存在相关性 （r=0.384，P＜0.05；r=0.396，P＜0.05；r=0.361，P＜0.05），见表 2。

表2 hsa-miR-144与血浆炎性因子相关分析（n=80）

3 讨论

结核性胸膜肥厚属于临床常见的呼吸内科疾病，其发病机制尚不清楚[7,8]。相关资料显示[9]，miR NA广泛参与细胞侵袭、细胞凋亡等多种过程，也参与免疫性疾病等多种疾病的发生发展。近年，hsa-miR-144在结核病发生发展过程中的调控作用逐渐受到人们的关注及重视。如谭燕[10]采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测显示，hsa-miR-144在肺结核病人血液中的表达明显高于健康人员，且患者经治疗后hsa-miR-144表达水平显著下降。本文结果显示，结核性胸膜肥厚组PBMC中的hsa-miR-144水平明显高于健康对照组（P＜0.01）。提示hsa-miR-144与结核性胸膜肥厚发生发展相关，通过检测外周血hsa-miR-144表达水平可用于结核性胸膜肥厚临床诊断与疗效评价。

作为一个重要的免疫调节因子，IFN-γ在结核感染中一方面可以促进Th1与巨噬细胞的炎症反应，另一方面可以抑制Th2与嗜酸粒细胞的炎症反应进而强化细胞的免疫应答作用[11]。TNF-α可以参与抗感染、发热等多种病理生理过程，在结核感染中可以激发局部免疫细胞释放许多趋化因子，诱导外周血单核细胞不断迁移到病变部位以诱发迟发型的变态反应[12,13]。有研究显示[14-16],IL-6与肺结核病变活动关系相关。本文结果显示，结核性胸膜肥厚组血浆炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6均明显高于健康对照组（P＜0.05）。提示结核性胸膜肥厚患者血浆中炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6存在异常表达。并发现hsa-miR-144的表达与IFN-γ、TNF-α、IL-6呈明显正相关,提示hsa-miR-144可能是通过促进致炎因子的表达，促进结核性胸膜肥厚的发生发展。

综上所述，检测体内hsa-miR-144及IFN-γ、TNF-α、IL-6细胞因子水平可以深入了解结核性胸膜肥厚的发病机制，有助于判断疾病进程，评价患者的预后。此外，通过分析hsa-miR-144及IFN-γ、TNF-α、IL-6在外周血中分泌水平差别，有可能成为结核性胸膜肥厚临床诊断的依据。