泡菜自然发酵中乳酸菌的分离鉴定及生物学特性的研究

2020-04-24戚家莉王海潮

农产品加工 2020年6期

戚家莉，王海潮

（1.安徽省寿县第一中学，安徽寿县 232200；2.宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州 234000）

泡菜能为人体提供所需的多种营养元素，其水分、碳水化合物、维生素、钙、铁、磷等[1-2]，泡菜富含0.4%～8.0%乳酸，经过乳酸菌的发酵，蔬菜的营养物质不仅没有被破坏，而且乳酸菌利用原料中可溶性物质代谢产生大量的乙酸、乳酸和多种氨基酸、酶、维生素等，提高了发酵蔬菜的营养价值[3-5]。泡菜具有保持肠道保健和消炎杀菌的功能，从泡菜中分离的乳酸菌含量很高，乳酸菌是参与调节人体肠道微生态平衡的主要菌系[6-7]。泡菜中的乳酸菌菌体及其代谢产生的维生素和有机酸对人体有多种功能，可帮助消化，促进胃肠道蠕动，代谢产物有机酸可使肠道内的渗透压增高，水分分泌亢进，粪便中水分增高而缓解便秘[8]；乳酸菌产生的有机酸对食品中微生物也具有较好的抑制作用。此外，泡菜中的乳酸菌有降低胆固醇、提高免疫力的功效[9-11]。

我国是蔬菜生产大国，蔬菜品种、人均消费和出口均居世界前列，每年的蔬菜产量为数亿吨，而发酵泡菜是蔬菜深加工的一种重要形式，目前国内外泡菜的加工工艺研究的热点主要集中在接种和发酵这个环节上，如发酵工艺条件的优化、乳酸菌菌种的选择等，直接影响着泡菜加工后的口感、色泽、滋味等品质及产品产量，是当今泡菜加工研究的热点[12-14]，而对自然发酵研究较少。传统自然发酵法是在一定的温度下将新鲜的蔬菜加入适当食盐及其他辅料，利用原料中原有的酶及所处环境内乳酸菌、耐酸性酵母等微生物进行发酵而制得最终发酵产品，最典型的产品就是泡菜。

试验以白贝自然发酵黄瓜、萝卜、胡萝卜等为原料进行自然发酵制作泡菜，从中分离得到性能优良的乳酸菌，并通过生理生化试验，对分离得到的乳酸菌进行鉴定，并对其生物学特性进行分析，为提高发酵泡菜的品质及其营养价值奠定一定的基础。

1 试验部分

1.1 试验材料

1.1.1 材料

黄瓜、萝卜、胡萝卜、食盐，均为市售。

1.1.2 仪器

YP202N型电子天平，上海精密科技仪器有限公司产品；电子万用炉，天津市泰斯特仪器有限公司产品；GI54DWS型高压灭菌箱，致微（厦门）仪器有限公司产品；SHP-250型生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司产品；SW-CJ-IFD型超净工作台，苏净集团安泰公司产品；DHG-9053A型恒温干燥箱，上海一恒科技有限公司产品；泡菜坛、烧杯、玻璃棒、三角烧瓶、试管、培养皿、接种环、接种针、显微镜、酒精灯、载玻片、香柏油、胶头滴管、移液管、洗耳球、玻璃涂布器、称量纸、pH试纸、脱脂棉、纱布、牛皮纸、细绳子、滤纸等。

1.1.3 试剂

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、葡萄糖、甲基红、95%乙醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、硫酸镁、柠檬酸钠、溴香草酚蓝乙醇液、硫代硫酸钠、醋酸铅、30%过氧化氢、对二甲基氨基苯甲醛、浓盐酸、乙醚、氢氧化钾、草酸铵、结晶紫、碘片、碘化钾、蕃红、明胶等。

1.2 试验方法

1.2.1 泡菜的制作

选择含糖丰富且质地嫩脆的萝卜、胡萝卜、黄瓜等蔬菜作为腌制泡菜的原料。用刀把不适于腌制的部分去除，如萝卜的菜叶及粗皮，并把萝卜、胡萝卜、黄瓜切成小块，方便装坛内进行腌制。整形后，把清洗干净的蔬菜晾晒3～4 h。在蔬菜装坛前直接用食盐腌制或是放入25%的食盐溶液，使蔬菜部分脱水变软。把处理过的蔬菜分别装入坛内，压紧，再使用蒸馏水配置好的质量分数为6%～8%的食盐水倒入罐内，食盐水一定要淹没蔬菜，盐水离坛口3～5 cm，防止泡菜腌制后盐水溢出影响泡菜的品质。然后盖上坛盖，并用保鲜膜裹紧，在厌氧条件下乳酸菌可以生长良好，同时也可以抑制好氧细菌及霉菌的生长。把装有原料的泡菜坛置于阴凉通风处，在温度10℃左右腌制10～15 d备用。

1.2.2 培养基的配制

（1）牛肉膏蛋白胨培养基。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g， NaCl 5 g，琼脂 15～20 g，水 1 000 mL， pH 值7.0～7.2。

（2）柠檬酸盐培养基。NH4H2PO41 g，K2HPO41 g，NaCl 5 g， MgSO40.2 g，柠檬酸钠 2 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水1 000 mL，1%溴香草酚蓝乙醇液 10 mL，将上述各成分加热溶解后，调节pH值至6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色。

（3）蛋白胨水培养基。蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.6。

（4）葡萄糖蛋白胨水培养基。葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，K2HPO42 g，蒸馏水1 000 mL，将上述各成分溶于 1 000 mL水中，调pH值7.0～7.2，过滤。

（5）醋酸铅培养基。pH值7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂100 mL，硫代硫酸钠0.25g，10%的醋酸铅水溶液1 mL，将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100 mL加热溶解，待冷却到60℃时加入硫代硫酸钠0.25 g，调pH 值7.2。

（6）明胶培养基。牛肉膏蛋白胨液100 mL，明胶 12～18 g，pH值7.2～7.4，在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。溶化后调pH值7.2～7.4。

所有培养基在121℃下灭菌20 min。

1.2.3 主要染色液的配制

（1）溴麝香草酚蓝指示剂。溴麝香草酚蓝0.04 g，0.01 mol/L NaOH 6.4 mL，蒸馏水93.6 mL，溴麝香草酚蓝pH值6.0～7.6，颜色由黄变蓝，常用质量分数为0.04%。

（2）甲基红试剂。甲基红0.04 g，95%乙醇60 mL，蒸馏水40 mL，先将甲基红溶于95%乙醇中，然后加入蒸馏水即可。

（3）吲哚试剂。对二甲基氨基苯甲醛 2 g，95%乙醇190 mL，浓盐酸40 mL。

（4）草酸铵结晶紫染液。结晶紫1 g，95%酒精20 mL，草酸铵0.8 g和蒸馏水80 mL，混合，静置48 h后使用。

（5）卢戈氏碘液。I21.0 g，KI 2.0 g，蒸馏水300 mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全溶后，加足水分即成。

（6）蕃红复染液。蕃红0.25 g，95%的酒精10 mL，蒸馏水90 mL，将蕃红溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。

1.2.4 乳酸菌的分离

用移液管分别吸取少量发酵好的泡菜汁液，置于平板中心处释放，然后用玻璃涂布器涂布均匀，并在培养皿外贴上标签，最后将培养皿放在37℃的恒温培养箱中培养48 h，观察菌的生长情况，若菌落太多形成菌苔，可对泡菜汁液进行适当的稀释再进行涂布。对其中具有典型乳酸菌菌落特征的菌株进行反复分离、纯化至纯菌落。从胡萝卜泡菜中分离出3株乳酸菌，分别是A-1，A-2和A-3菌株。从萝卜泡菜中分离出3株乳酸菌，分别是B-1，B-2和B-3菌株。从黄瓜泡菜中分离出4株乳酸菌，分别是C-1，C-2，C-3和C-4菌株。

1.2.5 乳酸菌的鉴定

（1）形态鉴定。把接种的牛肉膏蛋白胨平板后，倒置放在37℃的恒温培养箱中培养48 h，观察并记录不同泡菜中乳酸菌菌落的数目、种类、形状、大小、颜色、有无隆起、湿润情况、光泽度、边缘等形态学特征。

（2）生理生化鉴定。将纯化过的菌落进行挑取，分别接种到蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、明胶培养基以及过氧化氢酶试验培养基上，放在37℃的恒温培养箱中培养48 h，此操作在超净工作台上进行。观察菌的生长情况，培养基的颜色变化和加入变色剂后培养基颜色变化，并记录现象。

①柠檬酸盐试验。把黄瓜、萝卜、胡萝卜等泡菜中分离出来的乳酸菌分别接种在柠檬酸盐培养基上，此过程在超净工作台上进行，接种完毕后，把接种后的培养基放在37℃的恒温培养箱培养48 h，观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色，蓝色为阳性，绿色为阴性。②吲哚试验。把黄瓜、萝卜、胡萝卜等泡菜中分离出来的乳酸菌分别接种在蛋白胨水培养基上，此过程在超净工作台上进行，接种完毕后，把接种后的培养基放在37℃的恒温培养箱培养48 h，然后在培养基中加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1 min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。③甲基红试验。把黄瓜、萝卜、胡萝卜等泡菜中分离出来的乳酸菌分别接种在葡萄糖蛋白胨水培养基上，此过程在超净工作台上进行，接种完毕后，把接种后的培养基放在37℃的恒温培养箱培养48 h，然后在培养基中加入3～4滴甲基红试剂，培养基变为红色为阳性，变为黄色为阴性。④硫化氢试验。把黄瓜、萝卜、胡萝卜等泡菜中分离出来的乳酸菌分别接种在醋酸铅培养基上，此过程在超净工作台上进行，接种完毕后，把接种后的培养基放在37℃的恒温培养箱培养48 h，观察黑色硫化铅的产生。⑤明胶液化试验。把黄瓜、萝卜、胡萝卜等泡菜中分离出来的乳酸菌分别穿刺接种在明胶培养基上，此过程在超净工作台上进行，接种完毕后，把接种后的培养基放在37℃的恒温培养箱培养48 h，观察明胶是否液化。⑥过氧化氢酶试验。用接种针把分离纯化的乳酸菌涂抹在过氧化氢中，有气泡产生菌体含有过氧化氢酶。

2 结果与分析

2.1 泡菜的制作

泡菜腌制过后，颜色不太鲜亮，质地较软，味道爽口。萝卜与胡萝卜泡菜颜色变化较小，黄瓜泡菜的颜色由深绿色变成了暗绿色。3种泡菜坛的底部均有乳白色像牛奶一样的乳酸菌落。说明蔬菜在盐水质量分数为6%～8%的情况下会发酵产生大量的乳酸菌。

胡萝卜、萝卜和黄瓜泡菜见图1。

2.2 乳酸菌的分离

从胡萝卜、萝卜、黄瓜泡菜中分离出A-1，A-2，A-3，B-1， B-2， B-3， C-1，C-2，C-3 和C-4共10株乳酸菌。胡萝卜泡菜中含有A-1，A-2和A-3乳酸菌菌株；萝卜泡菜中含有B-1，B-2和B-3乳酸菌菌株；黄瓜泡菜中含有C-1，C-2，C-3和C-4乳酸菌菌株。

萝卜泡菜中乳酸菌菌落分布见图2。

2.3 乳酸菌的鉴定

2.3.1 形态学鉴定

从泡菜中分离出多株乳酸菌，选取其中占优势的10株菌进行鉴定，经革兰氏染色后在油镜下观察形状结构、菌落形态。这10株乳酸菌革兰氏染色均为阳性，无芽孢、无鞭毛、不运动，具有杆菌形态学特征。

泡菜乳酸菌的形态学特征鉴定结果见表1。

2.3.2 生理生化鉴定

（1）柠檬酸盐试验。所有泡菜中乳酸菌的柠檬酸盐试验的培养基，随着时间的推移，由深绿色变成深蓝色，说明乳酸菌可以利用柠檬酸盐作为碳源进行生长繁殖。

柠檬酸盐试验结果见表2。

（2）吲哚试验。所有泡菜中乳酸菌的吲哚试验反应结果，在乙醚和培养物之间产生红色环状物，为阳性反应。

吲哚试验结果见表3。

（3）甲基红试验。胡萝卜泡菜中A-1，A-2和A-3菌株的甲基红试验是阴性；萝卜泡菜中B-1，B-2和B-3菌株的甲基红试验是阳性；黄瓜泡菜中C-1和C-2菌株的甲基红试验是阳性，C-3和C-4菌株的甲基红试验是阳性。

甲基红试验结果见表4。

表1 泡菜乳酸菌的形态学特征鉴定结果

表2 柠檬酸盐试验结果

表3 吲哚试验结果

表4 甲基红试验结果

（4）硫化氢试验。所有泡菜中乳酸菌的硫化氢试验反应结果均为阴性，无黑色硫化铅形成。

硫化氢试验结果见表5。

表5 硫化氢试验结果

（5）明胶化试验。所有泡菜中乳酸菌的明胶化试验反应结果均为阳性，明胶由固体变成液体。

明胶化试验结果见表6。

表6 明胶化试验结果

（6）过氧化氢酶试验。所有泡菜中乳酸菌的过氧化氢试验均产生大量气泡。

过氧化氢酶试验结果见表7。

表7 过氧化氢酶试验结果

3 讨论

根据张刚的《乳酸细菌-基础、技术和应用》[15]中所提到的乳酸杆菌的标准可以得到乳酸杆菌可以利用糖作为碳源，但不可以分解利用蛋白质、氨基酸。但是，有个别试验的结果于此标准不符，例如崔艳伟等人[16]的乳杆菌的分离及鉴定试验。

试验上述个别试验结果与乳酸杆菌的标准结果不符，例如乳酸菌的吲哚试验和明胶化试验结果均为阳性，可能是由于乳酸菌菌株自身的某种特性或在培养过程中发生变异导致菌株的部分糖醇发酵结果发生改变，造成了生理生化鉴定的困难；也可能是细菌微量生化鉴定管产生的不确定因素所导致的。为了对分离菌株进行准确的鉴定，试验可以采用16S rDNA序列同源性分析方法进行进一步的鉴定，从而确定乳酸菌的菌种。