男子30 km跑后尿液蛋白质组差异性表达的研究

2020-04-24林文弢蔺海旗徐国琴翁锡全

天津体育学院学报 2020年1期

林文弢，蔺海旗，杨玲，徐国琴，翁锡全

尿液是血液经肾小球滤过、肾小管和集合管重吸收、排泄及分泌产生的终末代谢产物，较血液等其他体液具有采样简便、无创伤、可重复取材的特点。自1878年VON.LEUBE[1]在士兵行军时发现尿蛋白以来，国内外在运动性蛋白尿方面进行了诸多研究[2-3]。在运动训练中，尿蛋白不仅有量的改变且存在组份的差异[4-5]。受传统的蛋白质分离与鉴定技术所限，现研究多局限于尿总蛋白、Alb、β2-MG 等几个已知蛋白，难以对尿蛋白组进行高通量、快速的并行研究及全面、系统地阐释运动对机体影响的分子机制和内在规律。双向凝胶电泳（2-DE）和质谱（MS）技术的联合使用与飞速发展给蛋白质组学研究提供了很好的技术平台。T.MARSHALL等[6]指出尿蛋白组学是采用蛋白组学技术与方法，系统的分析与鉴定尿液中蛋白质分子，进一步探究其生物学功能。目前尿蛋白组研究在正常人和医学领域已取得一定成果，研究[7]显示，正常人尿液中已鉴定出3280种蛋白质，丰富了人类尿蛋白组数据库。在体育科学领域，有关尿液蛋白质组学的研究报道甚少，M.KOHLER 等[8]利用双向凝胶电泳+质谱（2-DE+MS）技术，研究不同项目（团体、耐力、力量）运动员运动后尿液蛋白质组份，发现不同运动项目之间的尿蛋白组份和2-DE 图谱表达存在差异。最近，研究团队[9-10]综述了蛋白组学研究在体育科研领域的应用进展和未来前景。

鉴于此，本研究从蛋白质组学整体的角度，探讨30 km 跑对尿液蛋白质组图谱差异性表达的影响，筛选对评价运动负荷和身体机能具有意义的目标尿蛋白，分析其功能及特点，为运动训练监控寻找一种无创、系统化的评价方法提供试验借鉴和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验器材

微量移液器购自法国Gilson 公司、高速冷冻离心机（Beckman）、等电聚焦仪（GE ETTAN IPGPHOR3）、垂直电泳槽（GE ETTAN DALTsix）、ImageMaster 2D platinum 5.0（GE）、MALDITOF-TOF 质谱仪（Bruker Dalton）。蛋白酶抑制剂PMSF、丙烯酰胺（Acylamide）、二硫苏糖醇（DTT）购自Amresco 公司；IPG Buffer pH 4～7（GE）、胎牛血清标准品BSA、NH4HCO3购自Sigma公司；N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、碘乙酰胺IAA购自Amersham公司；考马斯亮蓝G250购自Bio Basic公司；乙腈和十二烷基磺酸钠分别购自Fisher和Promega。

1.2 尿液采集

以参加30 km挑战赛10名男子为研究对象，身体健康且无泌尿系统疾病，具有一定长跑经验，基本情况见表1。研究对象以赛事规定线路绕星湖绿道跑2圈，15 km/圈。气温19 ℃，湿度约50%，微风。

表1 受试者基本情况（n=10）Table1 the Basic Information of the Subjects（n=10）

尿样采集：（1）晨尿的采集：睡前排空尿液，晨起前不再排尿。无菌瓶收集晨尿，并记录尿液容积以及睡前和晨起的采尿时间。随后根据各自尿液容积将30～50 mL 尿液分装于50 mL无菌Corning管，为避免蛋白酶解，每100 mL尿液加入1 mL PMSF（1 mmol/L），-80 ℃保存；（2）运动后尿样的采集：赛前排空，运动后15 min收集尿液，其他操作同（1）。

1.3 蛋白提取

样本复融后于4 ℃，6000 r/min，离心20 min，吸出上清，用孔径0.45 和0.22 μm 的滤膜分别过滤一次，丙酮沉淀过夜。然后沉淀蛋白4 ℃，离心20 min，12000 r/min，倾去上清并干燥后得蛋白团块，于-80 ℃保存。用600 μL Tris饱和酚将沉淀团块充分裂解后，加入600 μL提取液。然后4 ℃，12000 r/min，离心20 min，吸出上层酚相，移到EP 管内，重复操作一次。然后于-20 ℃以酚5倍体积的沉淀液沉淀蛋白过夜。沉淀蛋白4 ℃，12000 r/min，离心20 min，去上清；加1 mL 甲醇后吹打洗涤蛋白，12000 r/min，离心20 min，去上清；重复一次操作。晾干后-80 ℃保存备用。

1.4 双向凝胶电泳

（1）固相等点聚焦：干燥后的蛋白质经再水化液（RB）溶解和Bradford 法定量后，加入上样液（1% DTT、1% IPG Buffer、1×BPB、RB 至460 μL），上样量120 μg。胶条经泡胀过夜（10～12 h）后放入等电聚焦盘中。等电聚焦程序为：300 V 0.5 h、700 V 0.5 h、1500 V 1.5 h、9000 V 3 h、9000 V 5 h，总电压为64 kVh。

（2）SDS-PAGE垂直电泳：将平衡后的胶条移至12.5%的凝胶上端，用0.8%低熔点琼脂糖和1.5%的普通琼脂糖封闭。双向电泳：2 W/gel 45 min、17 W/gel 至溴酚蓝到底，大约4.5 h。

1.5 凝胶染色与图像分析

采用考马斯亮蓝G-250 染色法按照固定、漂洗、考染、漂洗的步骤进行凝胶染色。采用UMAX Powerlook1100 凝聚图像扫描仪对胶图扫描，采用Image Master 2D platinum 5.0 对图谱进行背景消减、斑点检测和蛋白匹配等分析，比较图谱差异蛋白点。

1.6 质谱分析

选取部分差异蛋白点进行胰蛋白酶胶内酶切。利用MALDI-TOF-TOF（Autoflex speed™）质谱分析。通过NCBI数据库，查询匹配蛋白，条件如下：物种来源：human；肽质量：800～4000 Da；一级质谱质量误差范围：50 ppm；二级质谱质量误差范围：0.5 Da；表观pI 与表观Mr 的误差范围：无限制；酶解片段不完全：1 个；电荷：+1；固定修饰：Carbamidomethy；同位素峰：monoisotopic；可变修饰：Oxsidation；鉴定分值（Score）＞66（P＜0.05）。

2 结果

2.1 双向凝胶电泳（2-DE）图谱特征

30 km 跑前、后尿液2-DE 电泳表达图谱见图1。如图所示，从左至右pH 值为4～7 逐渐增加，从下往上分子量递增，在10～130 kD 之间。从图中呈现的蛋白质分子量分布范围看，蛋白质分子量主要集中在20～80 kD 之间，大于80 kD 和小于20 kD 的蛋白质分子很少，各点染色深浅和面积有一定差异，表明蛋白质含量不同；从蛋白质的等电点来看，蛋白质的等电点多集中在4.5～6 之间，同时可见，左侧斑点较多，右侧斑点偏少，极碱性蛋白很少，说明尿液中酸性蛋白质（图谱左侧）多于碱性蛋白质（图谱右侧）。对运动前、后2-DE 图谱经软件分析和人工确认比较，显示运动前、后尿液蛋白质存在差异，主要表现在2-DE 图谱斑点的增减、面积大小及染色的深浅上。

图130 km运动前（左）与运动后（右）尿液蛋白质2-DE图谱Figure1 Representative 2-DE gel Images After Staining with Silver Nitrate for the Urine Sample from Athletes Before（Left）and After（Right）30 km Long-distance Running

2.2 双向凝胶电泳（2-DE）图谱差异性表达分析结果

对运动前、后尿液蛋白质2-DE 表达图谱进行分析，运动前、后平均检测到蛋白质点（1011±243）和（1737±15）个。运动前、后各重复电泳3 次，同时分别取一张胶为参考胶，其余胶与其匹配，匹配率分别为66.44%和73.02%，表明试验获得了良好的重复性。

2-DE 图谱经软件进一步分析，30 km 运动后与运动前相比，共有110 个差异性表达蛋白点，其中运动后表达量下调的点（含消失点）和表达量上调的点（含新增点）均为55 个，分别见图2、3。

图230 km运动后表达下调点图谱Figure2 Expression Downregulation Point 2-DE Maps of Urine Proteins from Athletes

图330 km运动后表达上调点图谱Figure3 Expression Upregulation Point 2-DE Maps of Urine Proteins from Athletes

在运动后差异表达量下调/上调的55 个点中，其具体数目及倍数分布情况见表2、3。

表230 km运动后差异表达量下调/上调蛋白点数目及倍数分布Table2 the Number and Change Folds of Differentially Expressed Proteins After Exercise

表330 km运动后差异表达≥5倍的蛋白点Table3 Information Related to the Proteins with Fold Change of ≥5

表430 km运动后差异表达蛋白点质谱鉴定结果一览表Table4 Protein Expression Levels in the Urine Samples from Athletes After Running Identified by MALDI-TOF-TOF

2.3 质谱鉴定结果

选择运动后差异表达量上调≥5 倍和新增的蛋白点10 个，利用MALDI-TOF-TOF-MS质谱仪对这些差异性蛋白质斑点进行检测，通过NCBI 数据库检索，鉴定出6 个蛋白（见表4）。其中，B37、B18、B25、B26、B43 同为白蛋白；运动前后6 个蛋白质的蛋白点视图（Spots view）见图4。

图430 km运动前后6个差异表达蛋白点视图Figure4 Differential 2-DE Analysis of Urine as Sampled Before and After the Race

3 讨论

机体运动可引起内环境、代谢产物以及营养状态等发生改变，进一步会影响有关基因的表达与蛋白的合成[11]，使运动前、后蛋白组图谱差异表达。本研究在对差异表达蛋白质斑点鉴定的基础上，分析其功能发现这些蛋白与机体能量代谢方式的转变、物质的转运、应激保护等有关。

3.130 km跑对尿液能量代谢相关蛋白的影响

锌α2-糖蛋白（zinc α2-glycoprotein，ZAG）是血清中一种可溶性糖蛋白[12]。最近研究表明，其是一种新型脂质动员因子，能促进脂肪分解，降低体重[13-14]；同时，也是诊断前列腺癌等疾患的一种生物标志物[15]。

目前，关于ZAG 和运动之间的研究还比较少。研究发现[16-17]，运动可使脂肪组织ZAGmRNA的表达水平上调，进而减脂，降低体重，提示ZAG可能是一调节脂代谢的候选基因。本研究中，ZAG运动后较运动前表达量增加5.2倍，其含量的增加很可能与机体为了满足30 km长时间耐力运动时能量的需求，而引起ZAG 蛋白合成率增加，加强脂肪动员和促进脂肪分解有关。研究表明，锌α2-糖蛋白可引起脂动员，促进BAT与肌肉组织表达解偶联蛋白，增加机体能量消耗和脂质利用[18]，这更进一步支持该观点。同时，M.KOHLER等[19]应用2-DE+MS技术在马拉松运动后尿液中也检测出ZAG，与本实验结果一致。目前，ZAG与运动尤其是脂肪细胞的功能相关研究文献很少，有待深入研究。

3.230 km跑对尿液应激保护相关蛋白的影响

维生素D 结合蛋白（vitamin D-binding protein，VDB）是一种多功能α-球蛋白，其包括白蛋白（ALB）、前白蛋白（PA）、甲胎蛋白（AFP）等，不仅具有携带维生素D 及血浆中的维生素D 的代谢物的功能[20]，同时还有促进清除肌动蛋白、增加补体C5 对中性粒细胞的趋化活性、调节破骨细胞活性、运输脂肪酸和内毒素的功能[21-23]。

目前有关VDB 与运动的研究甚少，本实验发现，受试者在30 km 运动前，尿液中尚未发现VDB，而在运动后作为新增点出现，这可能与长时间耐力运动时，代谢产物大量堆积以及肌组织有一定程度的损伤和局部炎症而致使肝脏细胞在这种运动应激条件下分泌VDB 增多，加强机体对代谢物的清除等功能，起到保护机体的作用有关，提示耐力运动可能致使机体肌组织伴有一定程度的损伤及炎症。目前，VDB 与运动的作用关系及机制知之甚少，有待于从定量的角度进一步更深入的研究与解析。

3.330 km跑对尿液细胞骨架相关蛋白的影响

肌动蛋白（Actin）是真核细胞中含量最丰富的蛋白质之一，它是细胞的一种重要的骨架蛋白。Actin分为3种类型，即α、β、γ-Actin[24]。β-Actin分布广泛，其是肌纤维及细胞骨架中具有收缩功能的一种主要蛋白成分。Actin 是构成骨骼肌肌原纤维细丝的主要蛋白，参与肌肉的收缩，协助完成机体机械活动。

本研究显示，30 km 长跑运动后，较运动前相比，运动后尿液中出现新增蛋白点β-Actin。β-Actin的表达量上调，分析原因可能是随着运动时间的延长而引起骨骼肌细胞内相关收缩蛋白的降解，这致使机体加强对收缩蛋白的合成来维持一定的运动能力及正常功能，进一步导致β-Actin 的表达量在血液中上调，而最终从尿液排出增多。同时，从肌损伤的角度来阐释，这与上述VDB表达量变化的原因十分相似，二者共同反映的结果显示，受试者在30 km 运动后骨骼肌在很大程度上可能存在一定的细胞膜通透性增加或损伤，也许二者共同联合探析运动对机体骨骼肌效应的化学本质具有重要意义。现有文献针对β-Actin与运动的报道目前国内尚未发现，有待于深入研究。

3.430 km跑对尿液转运蛋白相关蛋白的影响

白蛋白（albumin，Alb）是血浆中最丰富的蛋白，健康成年人24 h尿蛋白总量约为10～100 mg，定性结果为阴性。研究显示，尿Alb 含量可用于判断肾小球滤过膜通透性的改变。同时，尿Alb可作为诊断肾小球相关疾病[25]。

本研究发现，30 km长跑运动后，尿液中Alb 较运动前作为新增点出现，这和前期定量测试尿Alb结果趋势一致[26]，表明运动Alb 显著性增多，这可能与肾小球和（或）白蛋白膜的电荷改变有关。M.KOHLER 等[8，19]发现马拉松运动组较对照组比较，尿液蛋白质图谱中检测出Alb 以及其碎片，认为是由于运动刺激机体所引起，但同时也不排除相应机体患有肾小球肾炎疾病。在我们的研究中同样也发现类似的结果，并且Alb的残基、碎片较多。出现这种现象的原因，除M.KOHLER 的推测外，很大程度上应该还与蛋白翻译、修饰以及蛋白降解等多种情况致使同一个蛋白的不同修饰类型或者不同碎片出现在凝胶的不同位置，表现为多个蛋白点，鉴定结果类似有关。

3.530 km跑对尿液其它相关蛋白的影响

本实验研究结果显示，这里的其它蛋白是指与疾病有关的蛋白质，包括2种：前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）、本斯-琼斯蛋白（bence-Jones protein，BJP）。在医学领域，这2 种蛋白分别与前列腺和骨髓瘤肾损伤等疾患有关，并有可能是各自对应疾患的诊断标志物。

PSA是由前列腺腺泡及前列腺导管上皮细胞分泌的一种特异性糖蛋白。血清中PSA 的85%～90%与PMSF 结合，而10%～15%的PSA为游离状态，游离的PSA在血清中的含量甚微且恒定[27]。PSA 因有靶器官的特性，目前被认为是诊断前列腺癌的首选标志物。研究报道，任何引起前列腺细胞破坏的病理过程（炎症、尿潴留等）可致使血清PSA升高[28]。本研究显示，尿液中PSA运动后较运动前作为新增蛋白点出现，表明运动后尿液中PSA的浓度上升。究其因缘，可能与上述报道的长时间耐力运动引起机体炎症及尿潴留等因素破坏了前列腺细胞有关。上述因素可能进一步破坏了前列腺腺泡，细胞外PSA被带到血清中，使PAS含量升高，最终经肾脏外排增多。

BJP是免疫球蛋白分子的轻链，Kappa或Lambda链[29]。BJP也可偶尔出现在正常人尿中，可表示肾功能损伤。骨髓瘤患者的肾小管细胞基膜或管腔内均有蛋白沉淀，这意味着在生理条件下BJP 具不溶解性或分解代谢有缺陷。目前，BJP 在医学领域主要认为其与骨髓瘤肾损伤有关。本研究发现，运动后尿液中出现SJP 的原因尚不明了，推测可能与长时间运动造成肾小球/管暂时性损伤有关。

上述2 种疾病标志物蛋白在运动后出现，试验前，经询问，所有受试者均无相关疾病和病史，耐力运动后尿液中这2 种蛋白浓度增加的具体机制尚不明确，有待深入探讨；同时也反映出蛋白质组学这一技术检测蛋白质组份具有很高的灵敏性。