妊娠期肝内胆汁淤积症产妇胎盘血流灌注及AQP1表达的相关性研究

丁盛娣 唐杰 徐彬 张文渊

妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）是妊娠期特有的并发症，孕妇预后良好，但可导致胎膜早破、早产、胎儿宫内窘迫、羊水胎盘粪染及不可预测的胎儿突然死亡、新生儿颅内出血等不良妊娠结局［1］，其病理机制尚不明确。近年来研究表明，ICP 孕妇血清中高浓度胆汁酸可通过促进游离胎盘绒毛间隙狭窄，胎儿胎盘的血循环受阻，胎盘血流阻力增加，胎儿宫内缺血缺氧，最终导致胎盘灌注不足，从而影响胎儿预后不良的发生率升高［2］。水通道蛋白1（AQP1）是一种高度保守的疏水跨膜结合蛋白，主要表达于红细胞膜和血管内皮细胞，广泛分布于人体的各个组织，主要作用是显著增加细胞膜对水的通透性，参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡调节。本文探讨ICP 孕妇与胎盘灌注及胎盘组织上AQP1 mRNA 和蛋白表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015 年1 月至2018 年10 月本院产科急诊剖宫产的ICP 孕妇30 例为ICP 组，ICP 诊断标准：（1）生化指标：血清总胆汁酸≥10μmol/L，肝胆酸≥10.75μmol/L；（2）临床症状：有或无瘙痒；有或无黄疸。且均未接受过任何药物治疗的患者。同期选取无任何并发症的正常足月妊娠剖宫产的产妇30例为正常对照组。纳入标准：产妇年龄24～28 岁，均系足月单胎，无其他妊娠合并症和并发症，如：糖尿病、高血压、心血管疾病或者自身免疫疾病等，无催产素引产史，无药物服用史，无过期妊娠、胎儿畸形、胎儿生长受限及胎膜早破。本项目经本院伦理委员会批准，所有产妇均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）材料：Real-Time PCR 反应试剂均购自美国应用生物系统公司（ABI）；引物GAPDH、AQP1、委托美国ABI 公司合成；兔抗大鼠AQP1 抗体（Abcam 公司），HRP 标记羊抗人IgE 二抗购于北京中杉金桥公司；化学发光底物试剂盒垂直板型电泳仪、膜转移系统、凝胶成像系统均购自Bio-Rad 公司；低温高速冷冻离心机购自Eppdof 公司；彩色多普勒超声诊断仪购自美国GE 公司。（2）术前B 超监测：剖宫产术前床边B 超测量子宫动脉血流阻力指数（RI）、搏动指数（PI），以评估孕妇子宫胎盘灌注状态。（3）取材：符合诊断标准及纳入标准的产妇剖宫产术中胎盘娩出离体后取胎盘、胎膜及脐带组织，分装后置入-80℃冰箱保存备用。（4）检测方法：①两组足月孕妇取仰卧位进行超声检查，探头频率为3.5MHz，先对胎儿双顶径、胎盘、脐带、羊水等各个部位的情况进行检查，最后扫查胎盘基底部的子宫螺旋动脉，连续获取5 个心动周期的血流信号，计算RI 和PI。②Real-time PCR 检测胎盘、胎膜及脐带中AQP1 mRNA 表达:Trizol 试剂盒提取胎盘、胎膜及脐带中的总RNA，采用M-MLV 逆转录酶逆转录为cDNA，实时定量PCR 检测AQP1 的表达，25μl反应体系包括：20×TaqMan Gene Expression Assay 1.25μl，2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μl，cDNA 模 板3μl，补DEPC 无 菌 水 至25μl。PCR 循环参数为：95℃ 10min 预变性；然后95℃ 15s，60℃ 1min，并检测荧光信号，共40 个循环。引物: AQP1:正义链为5'-GGAGATGAAGCCCAAATAGAG-3'，反义链 为5'-GCTCTGAGACCAGGAAACAGA-3'；GAPDH 正义链为5'-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，反义链为5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3'。GAPDH 作 为 内参。每个样本重复3 次取平均值，反应结束后得出荧光反应曲线及CT 值。采用2-ΔΔCT 方法进行相对定量。③Western-blot 法检测胎盘、胎膜及脐带中AQP1 蛋白表达：蛋白裂解液提取胎盘、胎膜及脐带中蛋白质，用BCA 法测定蛋白质的浓度，制备聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）（12%分离胶，5%积层胶），取各样本30μg 进行蛋白质的SDS-PAGE，电泳结束后切取目标蛋白，半干转法转移至PVDF 膜，4% 脱脂牛奶封闭2h 后加入一抗（兔抗，1 ∶1000）4℃过夜，洗膜后加入HRP 标记的二抗（鼠抗，1 ∶2000）孵育，洗涤后与ECL 发光试剂反应，曝光洗片，扫描图像后Bio-Rad 图像分析系统计算各条带的灰度值，以β-actin 作为内参进行标准对照。每组实验重复3 次。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件。正态分布计量资料以（±s）表示，采用t 检验，计数资料比较采用Mann-Whitney U 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇胎盘灌注的超声特征 ICP 组孕妇子宫螺旋动脉PI 和RI 均显著高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 ICP组与正常对照组孕妇胎盘灌注的超声参数［m/s，（±s）］

表1 ICP组与正常对照组孕妇胎盘灌注的超声参数［m/s，（±s）］

注：与正常对照组比较，*P＜0.05

组别 n PI RI ICP组 30 0.631±0.085* 0.497±0.043*正常对照组 30 0.302±0.030 0.332±0.002

2.2 两组胎盘、胎膜及脐带中AQP1 mRNA 的表达 Real-time PCR 结果显示，ICP 组产妇胎盘、胎膜及脐带中AQP1mRNA 的表达均较正常对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且ICP 组中胎盘、胎膜中表达量较脐带中表达量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 ICP组及正常对照组各组织中AQP1mRNA的表达（±s）

表2 ICP组及正常对照组各组织中AQP1mRNA的表达（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05

组别 n 胎盘 胎膜 脐带ICP组 30 6.0237±1.276* 3.176±0.961* 5.997±0.803*正常对照组 30 1.045±0.141 1.178±0.254 1.031±0.200

2.3 两组胎盘、胎膜及脐带中AQP1 蛋白的表达 Western blot 结果显示，ICP 组产妇胎盘、胎膜及脐带中AQP1 蛋白的表达均较正常对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且ICP 组中胎盘、胎膜中表达量较脐带中表达量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 ICP组和正常对照组各组织中AQP1蛋白质的表达

3 讨论

有学者对ICP 产妇的胎盘病理检查发现胎盘小叶存在改变，绒毛间隙明显充血水肿，胎盘血流量不足，致使胎儿不能从母体中摄取足够的营养和氧气，继而影响其生长发育［3］。体外实验发现，高浓度胆汁酸有浓度依赖性血管收缩作用，可使胎盘绒毛静脉痉挛，影响胎盘血流灌注，进而影响胎儿营养及氧的交换，导致胎儿慢性低氧，甚至突然死亡［4］。本资料显示，ICP 发生时子宫动脉血流阻力指数及搏动指数均较正常对照组明显增加，从影像学上阐明胎盘血流灌注不足的存在，对早期干预、防止不良妊娠结局发生有较好的提示作用。

AQP1 是第一个被发现并认识的水通道蛋白，目前对其分子结构和生化特性的研究较为深入，其广泛分布于人体的各个组织，在产妇胎盘组织表达也多次被报道［5-6］。其不仅能影响机体的水和甘油代谢，且与羊水生成、转运也密切相关，在影响胎盘血流灌注方面的研究也初有成果［7］，但AQP1 在ICP 中是否参与胎盘血流灌注不足的问题尚未见报道。

本资料结果显示，ICP 组产妇胎盘、胎膜及脐带上AQP1 的表达较正常对照组明显升高，表明ICP 发生时胎盘灌注严重不足，AQP1 发生代偿性改变以期增加胎盘的血流。Zhang 等［8］研究中，采用实时定量PCR 和免疫组化方法，证实AQP1 在人胎盘的血管内皮细胞中有表达，认为AQP1 在维持胎盘灌注方面起重要作用。陈利琼等［9］研究发现子痫前期组胎盘上AQP1 的表达较正常妊娠组明显上调，提示胎盘组织中AQP1 的表达与子痫前期胎盘血管痉挛、胎盘灌注不足相关。

综上所述，ICP 胎盘发生灌注不足时，AQP1 会发生代偿性增加，提示可以对ICP 导致的不良妊娠结局提前干预，后续作者将对AQP1 在ICP 孕妇胎盘中作用的信号通路进一步研究。