硒对砷致雄性小鼠睾丸组织损伤的修复作用

武晓英，乔宏萍，刘桂兰，曹贵东

（1.太原师范学院生物系，山西晋中030619；2.天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，天津300308；3.山西瑞象生物药业有限公司，山西太原030032）

砷中毒可以抑制体内抗氧化酶的功能，使细胞的分裂和增殖紊乱，引起机体氧化损伤[1]，进而导致细胞死亡[2-3]。全世界有超过20个国家因高砷水源而引起砷中毒，我国也是受饮水型砷中毒危害最严重的国家之一[4-5]。砷污染是一个不容忽视的公共卫生问题[6-7]，在世界范围内严重危害着机体健康。砷中毒可直接损伤雄性生殖细胞的结构和功能，致使雄性生殖功能障碍、精子质量下降、繁殖性能受到严重影响[8-9]。硒（Se）是人体和动物必需的微量元素，具有对抗自由基，保护蛋白质、DNA以及染色质的结构和功能免受氧化损伤的能力[10]。硒和雄性动物的生殖关系也非常密切，它以硒蛋白的形式参与精子的发生过程和睾丸的正常发育。已有研究报道，硒的补充有效改善了鸡的精液品质，精子畸形率显著降低[11]。硒对重金属的毒性具有缓解作用，它有效改善了镉引起的氧化应激，提高了鸡免疫系统的防御能力[12]。目前，砷对睾丸发育的毒性研究已有大量报道[8-9]，但硒对砷中毒引起的睾丸毒性缓解作用并不清楚。

本试验选用昆明小鼠作为试验对象，采用砷饮水染毒处理并灌胃硒，通过小鼠抗氧化力、睾丸组织细胞的凋亡等检测，为硒对砷诱导的睾丸损伤缓解的作用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

选取4～6周龄，体质量20～22 g的雄性昆明小鼠18只用于试验。小鼠购自山西医科大学实验动物中心。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 18只健康的小鼠随机分为3组，每组6只连续称质量记录，分别为对照组（C组）、砷组（A组）和砷硒联合组（A＋Se组）。

小鼠预饲7d，之后进入试验期。3组小鼠自由采食，C组饮用蒸馏水，A组和A+Se组饮用含50mg/kg砷（As2O3）的蒸馏水，C组和A组每天1次灌胃0.5 mg/kg蒸馏水，A＋Se组每天1次灌胃0.5 mg/kg亚硒酸钠。连续处理60 d，试验结束后称小鼠体质量，同时解剖小鼠称睾丸组织质量。采用摘眼球法取小鼠血液析出血清冻存于-20℃冰箱，以测定抗氧化性能，同时解剖小鼠睾丸组织，制备切片用于组织病理学检测。

1.2.2 小鼠血清、睾丸组织抗氧化指标检测 小鼠血液样品析出血清后直接进行氧化指标检测；睾丸组织依据南京建成生物工程研究所提供的操作方法，用生理盐水制备10%的组织匀浆，离心取上清检测总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化力（T-AOC）活性及丙二醛（MDA）含量。

1.2.3 精子形态学观察 收集附睾中的精液，经离心获取精子，稀释至适当浓度后采用巴氏染色法制片进行观察，每个样品连续计数200个精子，测定精子畸形率。

1.2.4 小鼠睾丸组织HE切片制备 小鼠睾丸组织采用常规方法进行石蜡包埋后切片观察。病理切片制备过程为：10%中性甲醛溶液固定；乙醇梯度脱水；60～65℃下组织样品浸蜡；石蜡组织包埋；切片机切片；58～60℃烘干机烘片30～60 min；二甲苯脱蜡；苏木素伊红染色；乙醇梯度脱水封片；观察，拍照。

1.2.5 小鼠睾丸组织的TUNEL检测 小鼠睾丸组织用甲醛固定并制备石蜡切片，切片利用地高辛标记凋亡细胞DNA的3′-OH末端，通过生物素标记的抗地高辛抗体反应再结合SABC，最后加入DAB显色，于显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.3 数据分析

使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对细胞凋亡TUNEL结果进行分析，每个样本观察不少于5个视野，并计数阳性细胞数。试验数据用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，然后用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 砷、硒对小鼠体质量和睾丸组织质量变化的影响

在60 d的试验期，C组与A＋Se组小鼠饮食与生长发育良好，A组则从砷处理的第3周开始，食欲下降，生长迟缓，出现严重掉毛现象。从表1可以看出，C组小鼠体质量虽高于A＋Se组，但差异不显著（P＞0.05），C组和A＋Se组小鼠体质量均显著高于A组小鼠（P＜0.05）；A组小鼠睾丸组织质量极显著低于C组（P＜0.01），显著低于A＋Se组（P＜0.05）。

表1 不同组别小鼠体质量和睾丸组织质量比较 g

2.2 砷、硒对小鼠血清中抗氧化指标的影响

从表2可以看出，A＋Se组小鼠血清中T-SOD和GSH-Px的活性显著高于C组（P＜0.05），极显著高于A组（P＜0.01），A组活性显著低于C组（P＜0.05）；比较不同组别小鼠血清中T-AOC的活性，A+Se组极显著高于A组和C组（P＜0.01），C组显著高于A组（P＜0.05）；A＋Se组小鼠血清中MDA含量显著高于C组（P＜0.05），极显著低于A组（P＜0.01）。

表2 不同组别小鼠血清中抗氧化指标比较

2.3 砷、硒对小鼠睾丸组织抗氧化性能的影响

从表3可以看出，不同组别小鼠睾丸中T-SOD和GSH-Px的活性，A＋Se组显著高于C组（P＜0.05），极显著高于A组（P＜0.01），A组活性显著低于C组（P＜0.05）；不同组别小鼠睾丸中T-AOC的活性，A＋Se组极显著高于A组和C组（P＜0.01），C组显著高于A组（P＜0.05）；A＋Se组小鼠睾丸组织中MDA含量显著高于C组（P＜0.05），极显著低于A组（P＜0.01）。

表3 不同组别小鼠睾丸组织抗氧化性能比较

2.4 砷、硒对小鼠精子畸形率的影响

从表4可以看出，C组小鼠附睾中没有完全缺陷型精子，A组和A＋Se组小鼠附睾中都有完全缺陷型精子，A组极显著高于A＋Se组（P＜0.01），A＋Se组小鼠精子畸形率极显著低于A组（P＜0.01），显著高于C组（P＜0.05）；所有组别中畸形率发生最高的种类是颈部和中段缺陷。

表4 不同组别小鼠精子畸形率比较

2.5 砷、硒对小鼠睾丸组织HE染色与细胞凋亡的影响

由图1可知，C组睾丸组织中生精小管结构完整，生精上皮细胞排列规则，管腔大小均匀，管内有大量成熟精子，未见脱落细胞；A组为染砷组，生精小管形态结构受损，细胞排列松散，管腔增大，生精细胞和成熟精子数量减少，管腔内出现脱落细胞；A＋Se组为砷染毒同时联合添加硒组，与A组比较生精细胞数量增加，形态结构相对完整，对砷的毒性起到明显的拮抗作用。

从图2～3可以看出，A组小鼠睾丸组织细胞凋亡数量极显著高于C组与A＋Se组（P＜0.01），C组睾丸组织凋亡细胞数量虽低于A＋Se组，但差异不显著（P＞0.05）。A组睾丸组织中除精原细胞外，初级精母细胞和睾丸间质细胞也发生细胞凋亡。

3 结论与讨论

3.1 硒对砷染毒小鼠血清及睾丸组织抗氧化性能的影响

重金属元素可以引起氧化应激反应[13-14]，刺激机体产生大量的活性氧（ROS），破坏氧化系统和抗氧化防御系统之间的平衡，平衡一旦被破坏就会直接或间接损伤细胞内各种成分，组织受到氧化损伤。氧化应激也是砷毒性的重要原因[15]。LIU等[16]研究发现，铅能引起大鼠肝脏氧化应激。硒可以通过拮抗重金属元素保护机体，主要体现在能提高机体抗氧化系统中超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等重要抗氧化酶的活性[17]，保护细胞化合物免受ROS诱导的损伤[10]，维持蛋白质和DNA的结构以及功能的稳定。在小鼠铅中毒的研究中发现，硒能有效地缓解铅对小鼠造成的神经毒性[12]。本试验中，C组和A＋Se组小鼠的生长发育状态良好。A组小鼠3周之后表现为食欲下降、生长缓慢和掉毛的现象。通过检测各项抗氧化指标，A组小鼠血清和睾丸中T-SOD、GSH-Px和T-AOC的活性明显降低，添加硒后，A＋Se组小鼠血清与睾丸中SOD、GSH-Px和T-AOC的活性极显著高于A组（P＜0.01），显著高于C组（P＜0.05）；检测指标中的MDA是ROS破坏生物膜不饱和脂肪酸发生过氧化的产物。试验结果显示，A组小鼠生物膜受损严重，MDA含量极显著高于C组与A＋Se组（P＜0.01）。

3.2 硒对砷染毒小鼠睾丸组织细胞凋亡和精子形态的影响

细胞凋亡亦称细胞程序性死亡，是生命的基本现象，通过对凋亡机制的阐明可以揭示许多生理和病理现象的本质[13，18-19]。在精子发生过程中，生成的精子和死亡精子之间的动态平衡维持了精子的正常数量，由生精细胞的正常凋亡来维持。然而，生精细胞过度凋亡则可造成睾丸发育不全、精子发生异常，导致雄性不育[20]。氧化应激是砷致雄性生殖毒性及雄性不育的重要原因[15]。有研究表明，砷暴露会损伤小鼠睾丸结构、诱导睾丸氧化应激，减少附睾精子，引起精子发生障碍[21-23]。

本试验中，A＋Se组睾丸组织HE染色的结果显示，生精细胞数量较A组增加，形态结构较完整，明显对砷的毒性起到拮抗作用；而且细胞凋亡检测结果显示，A＋Se组睾丸组织中的细胞凋亡数目极显著低于A组，凋亡只发生于精原细胞，初级精母细胞和睾丸间质细胞没有发生细胞凋亡。