NF-κB家族亚基在不同品种绵羊背部皮肤中基因水平表达差异的分析

吴佳豪，董亚洁，张娇娇，陆 娜，薛霖莉，曹校瑞，张鹏翔，赫晓燕

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

随着人们生活水平的提高，毛纺织业的需求量日益增加，而羊毛的产量与质量直接影响着毛纺织业的发展。羊毛的质量指标主要有弯曲度、细度、密度、长度等，其中，弯曲度是其重要的生产性状之一，对加工过程中羊毛断裂损耗及毛纺品的柔软度具有重要的影响。美利奴羊引自国外，毛被质量均匀且密度大，毛发细长弯曲数多，是毛纺织品的优良原料；小尾寒羊是我国肉裘兼用型绵羊品种，毛较粗直呈波形或平展无弯，虽长度、细度和弯曲度都不及美利奴羊毛，但因其数量大、种类多，而成为毛纺织工业的主要原料，其纺织品质量较美利奴羊毛纺织品差。因此，若能改善小尾寒羊毛发弯曲性状，将对毛纺织工业具有重要意义[1]。

皮肤是机体重要的屏障和保护器官，毛囊是皮肤重要而复杂的附属结构，而毛发作为毛囊细胞增殖和分化的产物，是皮肤的衍生物[2]。因此，欲改善绵羊毛发弯曲性状，首先要了解毛发弯曲的分子调控机制，同时研究毛囊的发育生物学。近年来，有关毛发生长及发育的研究已有一定进展，但有关羊毛弯曲性状形成的分子机制研究并不多见，以至于影响羊毛弯曲性状形成的机制仍然没有系统的概述[3]。近20 a来，对小鼠、人等哺乳动物毛发纤维弯曲形成调控机制进行的研究虽已有了很大进展，但由于同源性的差异，羊毛弯曲性状形成的调控机制仍有待进一步探究。尽管不同种动物毛发的长度、细度、弯曲度等特性差异明显，且形成这些差异的分子机制尚不十分明确，但因毛囊发生、发育和毛发生长的分子调控机制被发现在许多哺乳动物中是相似的，这便为进一步探究羊毛弯曲形成的分子机制提供了一定的理论基础[3-4]。

目前，已发现多个参与毛发生长发育和毛囊形态发生所需的信号通路，如Wnt和EDA-A1/EDAR/EDARadd信号通路等[5-8]。这些信号通路中的配体、受体、信号分子和转录因子及其靶基因的遗传突变、表观遗传修饰和蛋白质翻译后修饰的改变等都会影响动物毛囊发育，造成毛发生长和品质方面的变化[8-12]。同时，众多文献表明，NF-κB与EDA-A1/EDAR/EDARadd信号通路关系密切，而EDA-A1/EDAR/EDARadd信号通路对于毛发弯曲性状的形成具有重要影响，因此，NF-κB存在对羊毛弯曲调控的可能性[13-17]。

NF-κB是SEN等于1986年首次在成熟B细胞、浆细胞中发现的一类具有多向转录调节重要作用的核蛋白因子，因其能与B细胞免疫球蛋白亲链基因的增强子（κB序列）特异性结合而得名。随后研究了解到，NF-κB广泛存在于组织细胞中，成分并不单一，由5种相关的转录因子构成，是一个大家族，它们分别是：NFκB1、NFκB2、RELA、RELB 和REL[18-21]。

本试验选取美利奴羊和晋中绵羊（属小尾寒羊）2个不同品种的绵羊作为研究对象，利用实时荧光定量PCR方法对不同品种绵羊背部皮肤中NF-κB各亚基的表达水平进行检测，旨在了解NF-κB家族各亚基基因水平的表达差异，分析在不同品种绵羊背部皮肤中与形成毛发性状差异相关的关键性基因，旨在为了解毛发性状形成相关分子调控机制提供途径，为进一步改善晋中绵羊毛发弯曲性状、促进毛纺织工业发展提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物及取材

选取山西省介休种羊场以相同条件饲喂的健康雌性3岁龄白色美利奴羊和晋中绵羊各4只。剃除各自背部相同部位的毛发后，利用取皮器进行皮肤样品采集，经生理盐水清洗处理后，置于液氮中保存，用于后续试验。

1.2 主要试剂及仪器

TrizolReagent（Invitrogen公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司）；SYBR PremixExTaqTMⅡ（TaKaRa公司）。

微量移液枪（Eppendorf公司）；超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；ND-1000微量核酸蛋白测定仪（NanoDrop Technologies公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；梯度PCR仪（Eppendorf公司）；MultilageTMLight Cabinet Filter Positions（Alpha Innotech 公司）；Mx3005PTMMultiplex Quantitative PCR System（STRATAGENE公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 引物设计与合成 以绵羊的18S rRNA作为内参基因。根据NCBI中登录的羊属NFκB1（登录号：XM_027970852.1）、NFκB2（登录号：XM_027960 471.1）、RELA（登录号：XM_027959295.1）、RELB（登录号：XM_015100238.2）、REL（登录号：XM_027966 801.1）与 18S rRNA（登录号：XR_003587981.1）CDS区的序列，利用Primer Premier 5.0设计特异性引物，引物信息如表1所示。引物均由华大公司合成。

表1 引物序列信息

1.3.2 提取总RNA 取液氮冻存的取材组织，按照Trizol试剂盒说明书分别提取美利奴羊与晋中绵羊背部皮肤组织样品中的总RNA；提取的总RNA使用ND-1000微量核酸蛋白测定仪，测定其纯度及浓度，并利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测各组织总RNA的完整性。

1.3.3 反转录合成cDNA 以检验合格的组织总RNA为模板，使用PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser（参照其说明书）反转录得到2种绵羊样本的cDNA模板，并调整浓度为100 ng/μL，置于-20℃保存备用。

1.3.4 实时荧光定量PCR 以1.3.3反转录得到的2种绵羊样本背部皮肤组织的cDNA为模板，以18SrRNA为内参基因，使用SYBRPremixExTaqTMⅡ（参照其说明书）进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本进行4次有效重复。PCR反应体系为：cDNA1μL，SYBR PremixExTaqTMⅡ（2×）5 μL，ROXReference Dye 0.2 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各 0.4 μL，ddH2O3.0μL。PCR反应条件为：95℃预变性10min；95 ℃变性 30 s，退火 30 s（表 1），72 ℃延伸 20 s，40个循环；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s。荧光信号值在退火时收集。

1.4 数据分析

实时荧光定量扩增所得Ct值，结果利用2-ΔΔCt法计算NF-κB家族各亚基在美利奴羊与晋中绵羊背部皮肤中mRNA的相对表达量；利用GraphPad Prism 5.0统计分析软件对数据进行差异显著性分析，其中，ns表示P＞0.05差异不显著，*表示P＜0.05差异显著，***表示P＜0.001差异极显著。

2 结果与分析

2.1 2种绵羊背部皮肤组织样本总RNA的提取

为探究NF-κB家族各亚基在美利奴羊与晋中绵羊背部皮肤中基因水平的表达差异，提取美利奴羊与晋中绵羊背部皮肤组织样本的总RNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果均可见5S、18S和28S这3条带，证明提取的各样本总RNA中基因组和蛋白质污染去除干净。同时经ND-1000微量核酸蛋白测定仪测定可知，所有样本总RNA的A260/A280值均在1.8～2.0。证明提取的各样本总RNA质量较好，符合后续反转录和定量分析试验的要求。

2.2 NF-κB家族单个亚基在美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中的定量表达

通过实时荧光定量PCR试验，以18S rRNA作为内参基因测定了目的基因在美利奴羊与晋中绵羊背部皮肤中的相对表达量，结果如图1～5所示，利用 2-ΔΔCt法计算得出，NFκB1 mRNA 在美利奴羊背部皮肤中的相对表达量是晋中绵羊的1.897倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA在美利奴羊背部皮肤中的相对表达量是晋中绵羊的2.025倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）；RELA mRNA在美利奴羊背部皮肤中的相对表达量是晋中绵羊的0.619倍，且差异达显著水平（P＜0.05）；RELB mRNA在美利奴羊背部皮肤中的相对表达量是晋中绵羊的1.791倍，但差异不显著（P＞0.05）；REL mRNA在美利奴羊背部皮肤中的相对表达量是晋中绵羊的1.819倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）。NF-κB各亚基mRNA在美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中的相对表达量均有差异，除RELA外其余各亚基mRNA的相对表达量在美利奴羊皮肤中均高于晋中绵羊。

2.3 美利奴羊背部皮肤中NF-κB家族各亚基的定量表达

在美利奴羊背部皮肤样本中，NF-κB家族各亚基mRNA表达情况如图6所示，RELB mRNA相对表达量最低，NFκB1 mRNA相对表达量是RELB mRNA的83.631倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA 相对表达量是 RELB mRNA的132.871倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）；RELA mRNA相对表达量是RELB mRNA的94.085倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）；RELB mRNA相对表达量是RELB mRNA的26.129倍，且差异达显著水平（P＜0.05）。

2.4 晋中绵羊背部皮肤中NF-κB家族各亚基的定量表达

在晋中绵羊背部皮肤样本中，NF-κB家族亚基mRNA表达情况如图7所示，RELBmRNA相对表达量最低，NFκB1 mRNA相对表达量是RELB mRNA的78.960倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）；NFκB2 mRNA相对表达量是 RELB mRNA的117.527倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）；RELA mRNA相对表达量是RELB mRNA的272.238倍，且差异达极显著水平（P＜0.001）；REL mRNA相对表达量是RELB mRNA的25.732倍，但差异不显著（P＞0.05）。

3 结论与讨论

羊毛是由皮肤内的毛囊发育而来的，毛囊在皮肤上成群分布，其生长是一个非常复杂的生理生化过程，主要包括毛乳头可增殖细胞旺盛的分裂、分化、角质化和迁移等过程。经过毛囊周期过程中生长期、退行期和休止期的不断更替，毛球与毛乳头间的营养联系不断变化，毛球细胞增殖过程受其影响，毛根形态因此而发生改变，毛纤维在毛鞘内的状态也随之产生变化，从而使羊毛发生性状方面的改变，如粗细、长短和弯曲程度方面的改变等[17]。因此，绵羊毛发性状取决于其皮肤内毛囊的结构和特性[2]。

毛囊的生长发育状况非常复杂，受遗传、环境、营养等多方面的影响，不同品种动物毛囊的结构特性差异明显，因而不同物种所表现出的毛发性状也各不相同。越来越多的研究表明，不论是遗传、环境还是饲养条件的差异，所造成的影响都会通过体内分泌产生的一些相关细胞因子作为中介来实现其想要产生的结果[4]，即毛囊结构和特性的差异实际是受细胞因子表达水平的强烈制约和影响的。作为体内分泌协调基因和环境的重要因子，细胞因子及其受体构成了调控毛囊形成发育和毛囊周期性生长的复杂网络，继而对羊毛生长的调控起着极其重要的作用[3，22]。因此，毛发性状差异可能就是细胞因子表达水平差异的结果[23]。

本研究通过实时荧光定量PCR试验发现，NF-κB家族各亚基在美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中基因水平的相对表达量存在差异。其中，NFκB1、NFκB2、RELB、REL 这 4 个亚基 mRNA 在美利奴羊的相对表达量均高于晋中绵羊，且分别是后者的 1.897倍（P＜0.001）、2.025倍（P＜0.001）、1.791倍（P＞0.05）、1.819倍（P＜0.001），表现出与性状差异的正相关性，表明美利奴羊良好的弯曲性状可能受到四者或四者之中某个亚基或某2个、某3个的正调控作用。与其他4个亚基形成鲜明对比的是RELA亚基mRNA在美利奴羊的相对表达量仅为晋中绵羊的0.619倍（P＜0.05），表现出与性状差异的负相关性，表明美利奴羊的弯曲性状可能受到其负调控作用。有研究表明，当毛乳头中角质形成细胞分裂、迁移速率加快并引发角质化过程时，毛发纤维是直的；当细胞分裂、迁移速率过慢使角质化速率降低时，角质化可能发生在真皮乳头，此时毛发纤维呈卷曲状[14，24]。RELA对于细胞的分裂、分化和凋亡起着重要的调控作用，细胞的分裂水平和能力与RELA表达水平呈明显的正相关[25]。本试验表明，可能由于美利奴羊RELA mRNA的相对表达水平显著低于晋中绵羊，从而使得形成毛纤维的角质形成细胞分裂能力较晋中绵羊更低，因此使得毛发的弯曲性状比晋中绵羊更显著。

单一物种方面，美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中RELB、REL的相对表达量都很低，这与文献中RELB主要见于胸腺、脾脏、淋巴结等免疫器官中参与炎症反应和免疫反应，而REL多见于造血细胞中的表述相符[19-20]。美利奴羊中，NFκB2 mRNA的相对表达量最高，RELA mRNA次之，表明NFκB2可能对于其毛发性状的形成影响更为直接；而晋中绵羊中，RELA mRNA的相对表达量最高，NFκB2 mRNA次之，表明RELA对于其毛发性状的形成影响可能更大。结合各亚基在美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中基因水平的相对表达量结果推测，NFκB2与RELA适当的相对表达水平对于毛发的弯曲性状可能具有重要的调控作用。

EDA-A1/EDAR/EDARadd信号通路的激活是一复杂的生理过程，即EDA-A1与其受体EDAR结合进而激活胞内受体EDARadd，然后释放出大量游离的NF-κB，NF-κB入核并调控核内靶基因的转录，从而调节多种生理活动[5，10]。同时，众多文献表明，该家族成员以一定的形式两两结合，形成不同的NF-κB转录因子，这些转录因子与核DNA特异性结合的位点不同，有的促进基因转录，有的则抑制基因转录[20-22]。若要进一步了解NF-κB对于毛发性状形成的相关分子调控机制，则需做进一步的探索和研究。

本试验表明，NF-κB 家族的 NFκB1、NFκB2、RELA、RELB和REL各亚基在美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中基因水平的相对表达量均有差异，其中，美利奴羊皮肤中NFκB2mRNA相对表达量最高，RELA mRNA次之；而晋中绵羊皮肤中，RELAmRNA相对表达量最高，NFκB2 mRNA次之。揭示NFκB2可能对于羊毛弯曲性状的形成具有促进作用，RELA可能对于羊毛弯曲性状的形成具有抑制作用，并且NFκB2与RELA适当的相对表达水平可能对于毛发弯曲性状的形成起重要的调控作用。