UV-B辐射对谷子叶色及米色形成的影响

郝瑞丽 ，王 喆 ，李 萌 ，张 彬 ，韩渊怀 ，申慧芳

（1.山西农业大学文理学院，山西太谷030801；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

自然界中紫外线按波长的长短分为长波紫外线（UV-A，320～400 nm）、中波紫外线（UV-B，280～320 nm）与短波紫外线（UV-C，200～280 nm）。研究表明，UV-A对植物影响极小，但UV-B对植物的光合作用、生理生化及抗氧化系统等方面均有较显著影响[1-2]。20世纪以来，平流层臭氧层变薄，到达地表的UV-B辐射增强[3]。近年来，UV-B辐射增强对植物所造成的影响引起研究者们的关注，已在小麦、玉米、水稻以及大豆等作物上进行了大量研究，并取得了一定研究进展[4-6]。许多研究表明，UV-B辐射会干扰、抑制植物的光合作用（如光合色素含量降低、光合速率降低以及光合作用过程中关键酶受抑制等）[7-8]，导致植物光合能力下降，最终对植物的生长、发育和繁殖过程产生负面影响。且有研究发现，UV-B辐射能够通过激发植物自身机体的抗氧化系统来提高抗氧化能力[9]，如 SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性增强。谷子是我国北方重要的杂粮作物，但有关UV-B强度对谷子光合等生理指标及米色的研究报道还较少，因此，研究谷子对UV-B辐射增强产生的生理响应具有重大理论与现实意义。

谷子（Setaria italica（L.）Beauv.），属禾本科狗尾草属，古代称禾，又名粟，经脱壳处理后称小米[10-11]，具有生育期短、耐旱及贫瘠土壤、适播时间长、耐储藏等优势，在我国旱作农业中具有深远的影响[12-13]。随着社会的不断发展，人们生活水平不断提高，对各种食物的要求也逐渐提升。对于小米而言，米色能够直观反映小米品质的优劣[14]，是谷子品质评价中的重要指标。有研究表明，小米颜色不同的谷子品种其营养品质也具有明显差异，小米颜色与其蒸煮后米饭、米汤的色泽、香味及适口性等呈极显著正相关，小米颜色越黄，米饭、米汤的色泽、香味及适口性越好[15-16]。同时还发现，小米中黄色素含量与其外观品质也呈显著正相关，而类胡萝卜素是黄色素的主要成分，因此，小米颜色与类胡萝卜素的积累具有一定相关性[17]。

类胡萝卜素是一类由异戊二稀组成的萜类化合物大家族，常于高等植物的花与果实色素母细胞中积累，使其呈现黄色、橙色或红色，且其结构超过600多种，常见的为β-胡萝卜素和茄红素。类胡萝卜素不仅是植物光合作用中的保护剂，而且具有食疗、保健功能，如具抗癌功能、降低血管发病率等。随着谷子营养及保健功能的研究与开发，食用小米需求量日益增大，进一步开发利用天然类胡萝卜素资源已成为一个发展趋势。

植物能够通过自身生理生化过程来自我调节而适应UV-B辐射胁迫。本研究通过对不同强度UV-B辐射处理下不同品种谷子幼苗叶片光合色素、抗氧化酶等生理生化指标以及米色等的测定与分析，旨在探究UV-B辐射胁迫下谷子幼苗的抗逆生理生化相应抗性模式，为谷子抵御UV-B辐射机制的研究以及今后培育富含类胡萝卜素的优良谷子品种奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试谷子材料为吨谷和沁黄2号，由山西农业大学杂粮分子育种团队提供。

1.2 试验方法

1.2.1 供试材料的种植及UV-B辐射处理 将供试材料的种子于2019年5月上旬经自来水4℃浸泡36 h后，播种于山西农业大学农学院挂藏楼温室气候室进行幼苗培育，待其长至七叶期进行紫外灯管照射及遮膜处理来模拟UV-B辐射的增强与减弱，设置为UV-B＋与UV-B-处理组，以自然光处理为对照组，分别处理10、20、30 d后进行旗叶的采集用于各指标的测定。所用紫外灯管（波长范围290～400 nm，峰值310 nm）购自北京光电源研究所，UV-B强度平均为223.8 μW/cm2，每天照射时间为 9：00—17：00；UV-B- 处理组加遮 KS-60 隔紫外线膜处理后其UV-B强度平均为4.24 μW/cm2；对照组UV-B强度为95.43 μW/cm2。测量UV-B强度所用的紫外辐照计（UV-297 nm），为北京师范大学光电仪器厂生产[18]。

同时将浸泡种子播种于山西农业大学试验田，采取随机区组设计，设置3个生物重复进行材料种植，待抽穗期对植株进行遮KS-60隔紫外线膜处理，设为UV-B-辐射处理组，UV-B强度均值为43.9 μW/cm2，自然光照为对照组，其UV-B强度133.18 μW/cm2，直至籽粒成熟收获。

1.2.2 叶片光合色素含量测定 分别对吨谷、沁黄2号2个品种谷子处理10、20、30 d的倒二叶进行叶绿素、类胡萝卜素含量测定和分析。紫外处理至10、20、30 d时，2个谷子品种分别取3株，每株取旗叶中部，去中脉、剪碎并混匀。称取3份，每份0.2 g，作为3个生物重复；用液氮研磨成粉末置于10 mL离心管中，分别加入6 mL丙酮和乙醇（2∶1，V/V）混合溶液进行提取，室温避光条件下在振荡器中振荡24～48 h，直至组织变白，12 000 g离心10 min，以乙醇和丙酮混合液为参比，测定其645、633 nm处吸光值，每个品种重复3次。计算方法参照文献[19]进行。

式中，Chl a、Chl b、Chl分别为叶绿素 a、叶绿素b、叶绿素总量，单位均为mg/g；V为提取液体积；W为样品质量；A645、A663分别为波长645、663 nm下的吸光值。

1.2.3 酶活性等指标的测定 采用氮蓝四唑光还原法测定SOD活性；用愈创木酚法对POD活性进行分析[20]；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法[21]；CAT活性测定参照文献[22]进行。

1.2.4 米色的测定 使用非接触式色差仪（X-Rite VS450 colorimeter）对米色进行测定与分析，采用CIE L*a*b*色度系统，测定指标L*代表亮度，a*代表红色/绿色度（正值代表红色，负值代表绿色），b*值代表黄色/蓝色度（正值代表黄色，负值代表蓝色）[23]。每个样品进行3次重复，取平均值。

1.2.5 籽粒总类胡萝卜素提取及含量测定 将色差测定后的小米参照AACC法[24]，用水饱和正丁醇在避光条件下对其进行总类胡萝卜素提取。将所挑选的小米用研磨机充分研磨获得小米粉，过0.149mm筛以保证米粉粗细均匀，称取0.6g于10mL离心管，分别加入6mL水饱和正丁醇，充分混匀，置于HY-4型调速多用振荡器上室温振荡3 h，8 000 r/min 4℃下离心15 min，收集上清液。以水饱和正丁醇作参比，使用紫外可见分光光度计测定A450，每个样品进行3次生物学重复。

式中，A450为450 nm处吸光值；0.250为转换系数；V为提取液体积；m为样品质量。

1.2.6 类胡萝卜素成分及其含量测定 使用高效液相色谱法（HPLC）测定籽粒中类胡萝卜素成分与含量。色谱条件：色谱柱为C30柱；流动相A为甲醇∶MTBE∶水＝81∶15∶4（体积比）；流动相B为MTBE∶甲醇＝90∶10（体积比）；检测波长为450nm；温度为35℃；流速为1 mL/min；进样量为20 μL；采用梯度洗脱，分别设0～20 min，流动相B 0～22.2%；20～25 min，流动相 B22.2%～0；25～30 min，流动相B0。

标准曲线绘制：将1 mg叶黄素和玉米黄质标准品分别用水饱和正丁醇稀释为：叶黄素48、4.8、0.96 μg/mL；玉米黄质 15、7.5、1.5 μg/mL。以进样量（μg/mL）为横坐标 X，峰面积（mAU·min）为纵坐标Y，进行线性回归分析，得出线性回归方程：叶黄素为Y＝2.270 7X（R2＝0.999 1）；玉米黄质为Y＝2.578 5X（R2＝0.999 32）。叶黄素与玉米黄质均在0.034～50 μg/mL范围内线性关系较好，检测限分别为0.013、0.016 μg/mL。进样前须将总类胡萝卜素提取液用0.45 μm过滤器进行过滤，将滤液装于液相色谱棕色试样瓶待用，在上述色谱条件下进行上机测定，每样品进行3次生物学重复，取平均值。

1.3 数据处理

使用Excel对试验所测数据进行统计整理、数据处理以及绘图分析，并使用IBMSPSSStatistics 20软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 UV-B辐射处理对谷子幼苗叶片光合色素含量的影响

由图1可知，随时间的推移，吨谷UV-B＋处理组类胡萝卜素含量呈现先上升，20 d后持续下降趋势，UV-B－处理组始终处于下降趋势，30 d后二者均显著低于对照组，叶绿素含量变化趋势同类胡萝卜素含量相似，2个处理组均显著低于对照组。沁黄2号UV-B－处理组类胡萝卜素及叶绿素含量开始均略微上升，20 d后均呈持续下降趋势，UV-B＋处理组2个色素含量开始均缓慢下降，20 d后迅速下降，30 d后均显著低于对照组。

2.2 UV-B辐射处理对谷子幼苗叶片保护酶活性的影响

分别对不同处理下谷子叶片进行酶液的提取，对其SOD、POD、MDA、CAT进行测定，探究其不同UV-B条件下对叶片保护酶活性的影响。由图2可知，与对照组相比，吨谷与沁黄2号UV-B＋处理组谷子苗期SOD、POD活性均随时间增加逐渐升高，说明UV-B辐射增强可以提高谷子幼苗的抗氧化防护酶活性；而UV-B-处理组SOD活性呈先升高后逐渐下降，30 d时低于处理组；对于POD，UV-B-处理组呈先下降，20 d后逐渐上升的趋势。

植物遭受外界逆境胁迫时，细胞膜结构和功能会最先受到伤害，MDA含量高低是抗逆生理中衡量植物细胞膜受伤害程度的重要指标之一。由图2可知，UV-B＋与UV-B-处理组随着处理时间的增加，MDA含量都呈升高趋势，但是30 d时，吨谷2个处理组均显著低于对照组，而沁黄2号2个处理组高于对照组，说明UV-B辐射对沁黄2号叶片细胞膜结构的胁迫程度要高于吨谷。MDA含量对UV-B辐射处理下谷子幼苗叶片的细胞质膜结构具有一定保护作用。

对于CAT，吨谷与沁黄2号UV-B＋和UV-B-处理组呈现相似趋势，随着处理时间的增加，均呈现先降低后升高的趋势，30 d时吨谷UV-B＋处理组低于对照组，UV-B-处理组逐渐高于对照组，而沁黄2号UV-B＋与UV-B-处理组始终高于对照组。

2.3 UV-B辐射处理对米色的影响

用色差仪（X-Rite VS450 colorimeter）对米色 L*、a*、b*这3个指标进行测定，结果如图3所示。由图3可知，吨谷与沁黄2号在UV-B-处理下L*、a*、b*值变化具有一致性，吨谷UV-B-处理组L*、a*、b*值均低于对照组，分别为L*值降低了9.7%，a*值降低了2.9%，b*值降低了3.3%；沁黄2号UV-B-处理组 L*、a*、b*值降低程度更大，L*值降低 72.6%，a*值降低22.2%，b*值降低23.9%。

2.4 UV-B辐射处理对籽粒总类胡萝卜素含量的影响

由图4可知，在UV-B强度降低条件下，吨谷的小米总类胡萝卜素含量降低，UV-B-处理组较对照组降低了8.97%，沁黄2号的小米总类胡萝卜素含量比对照组降低了2.8%。

2.5 UV-B辐射处理对叶黄素和玉米黄质含量的影响

小米呈黄色主要原因是存在有黄色素，而类胡萝卜素为黄色素的主要成分，通过HPLC分离小米中类胡萝卜素组分，比较叶黄素和玉米黄质2个组分的含量变化，进而明确不同UV-B强度下小米总类胡萝卜素组分的含量变化及差异。

由图5可知，叶黄素保留时间约为10 min，而玉米黄质约为11 min。通过对照小米总类胡萝卜素提取液的色谱图，可将其中叶黄素与玉米黄质分离，当出现峰与标准品保留时间一致时，即为标准品对应的组分。

根据叶黄素和玉米黄质线性回归方程求得叶黄素和玉米黄质含量，如图6所示。

从图6可以看出，吨谷与沁黄2号2类胡萝卜素组分变化具有一致性，与类胡萝卜素含量变化相符。吨谷UV-B-处理组叶黄素含量较对照组降低14.5%，玉米黄质含量降低13.0%；沁黄2号UV-B-处理组叶黄素含量较对照组降低9.4%，玉米黄质含量降低7.7%。

3 结论与讨论

3.1 不同UV-B强度对叶片光合色素含量的影响

叶绿素位于类囊体膜上，是主要的光合色素。研究表明，当植物处于UV-B辐射条件下，体内光合色素的含量会下降[25]。王小菁等[26]研究发现，UV-B增加对叶绿素、类胡萝卜素含量有着明显的影响，UV-B可引起大豆、黄瓜等植物叶片叶绿素及类胡萝卜素含量的下降。SINGH等[27]对豌豆进行UV-B处理，研究表明，体内类胡萝卜素含量出现急剧下降。冯虎元等[28]研究表明，UV-B辐射剂量增强，导致多数大豆品种光合色素（叶绿素a、叶绿素b）含量减少，类胡萝卜素含量降低。本研究中，UV-B＋处理组类胡萝卜素与叶绿素含量在20 d前均呈现略微上升趋势，说明在UV-B一定处理范围内有利于色素的积累，也可能是谷子试图适应该时期UV-B辐射的一种生理生化反应；而20 d后随着辐射量的累积及光合作用影响时间的延长，色素含量均呈下降趋势，这一结果与多数报道相同，UV-B辐射抑制了叶绿素的含量，原因可能是加速了叶绿素的分解或抑制了叶绿素的合成，从而导致叶片叶绿素含量降低[3]；而UV-B-处理下色素含量下降，可能是在降低UV-B强度条件下影响了光合作用的进行，使色素积累下降。总体而言，UV-B＋及UV-B-条件下叶片色素积累均下降，说明了UV-B过高与过低都不利于植株光合作用的进行及色素积累。

3.2 不同UV-B强度对抗氧化保护酶的影响

作物自身机体内的抗氧化系统在UV-B辐射增强条件下会被激发，其抗氧化能力提高。杜照奎[29]研究发现，在大田中将花生植株置于UV-B辐射强度为 54 μW/cm2条件下处理 2 d（每天 8 h），叶片中SOD、CAT和POD等组成酶类抗氧化系统的酶活性均显著增强。MAHDAVIAN等[30]研究发现，用UV-B对辣椒进行辐射处理，其体内许多酶如POD、PPO、CAT以及GR的活性都得到大幅提升。本研究中，UV-B＋处理组SOD、POD活性随着处理时间的增加而升高，与前人的研究结论基本一致，表明在UV-B辐射增强条件下谷子机体内抗氧化酶SOD、POD活性增强，以此适应UV-B对其产生的外界抗逆反应；而UV-B-处理下其SOD、POD活性变化呈相反状态，仍有待研究。本研究中，2个UV-B处理条件下CAT活性均略微下降，20 d后逐渐上升，可能20 d前UV-B胁迫强度不够，而在20 d后随着胁迫强度的增加，激发了自身的抗氧化能力，CAT活性逐渐升高。研究发现，UV-B辐射能够诱导产生氧自由基O2-、H2O2等，使得防御系统失衡而导致膜脂质过氧化，最终MDA积累增加[31-32]。本研究中，2个谷子品种在UV-B＋和UV-B-处理下MDA含量均呈持续上升趋势，与前人结论相一致。

3.3 不同UV-B强度对小米总类胡萝卜素及其成分与含量的影响

UV-B辐射通过影响植物生理、生化代谢反应进而对植物的生长与发育产生影响[33]。不同UV-B辐射强度对植物品质的影响有一定差异，南非醉茄在温室环境下增加UV-B辐射强度，其体内类胡萝卜素、花青素、番茄红素及类黄酮等含量普遍增加[34]。张文会等[3]研究表明，UV-B处理导致大豆植株类胡萝卜素含量增加。本研究中，吨谷UV-B-处理组较对照组类胡萝卜素含量降低8.97%，沁黄2号UV-B-处理组较对照组降低2.8%；在类胡萝卜素成分及含量测定中，吨谷UV-B-处理组叶黄素含量较对照组降低14.5%，玉米黄质含量降低13.0%；沁黄2号UV-B-处理组叶黄素含量较对照组降低9.4%，玉米黄质含量降低7.7%，这与前人研究结果相一致，表明在UV-B降低条件下，光合作用受到抑制，不利于色素的累积，导致小米中类胡萝卜素含量降低。