初步探索DIM-C-pPhOH（NR4A1 拮抗剂）对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用及作用机制

徐杨熙 黄海韬 马逸 王斌 王全才 李岩峰 周建波 董经宇

胶质瘤是中枢神经系统最常见的侵袭性恶性脑肿瘤之一[1]。目前胶质瘤的综合治疗取得了很大的进展，但在中位生存期和5 年生存率方面的改善微乎其微[2]。导致这种情况的主要原因是胶质瘤的侵袭生长及放射治疗、化学治疗的不敏感性。因此，找寻可以限制胶质瘤侵袭并抑制胶质瘤增殖的药物，并研究其作用机制，可以为胶质瘤的治疗提供新的靶点。孤儿核受体4A1（nuclear receptor 4A1，NR4A1）在大脑亚细胞区域广泛存在，为多巴胺能神经元功能所必需的。受体基因家族NOR-1（NR4A3）、Nurr1（NR4A2）及Nur77（NR4A1）是由血清、生长因子、受体参与和诱导凋亡刺激的直接早期基因，具有相似的结构特征，并且没有已知的天然配体。由于其生理配体尚未被确定，被归类为孤儿受体[3]。本文应用NR4A1 拮抗剂（DIM-C-pPhOH）研究其在胶质瘤细胞以及小鼠胶质瘤模型中的作用。

材料与方法

一、主要药物、试剂与仪器

DIM-C-pPhOH（纯度98.96%，MCE 公司，美国）溶解于二甲基亚砜中，储备液浓度10 mmol/L。CellTiter 检测试剂[普洛麦格（北京）生物技术有限公司]，超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），高速低温离心机、台式常温离心机（Eppendorf 公司，美国）；CO2培养箱（Thermo 公司，美国）。

二、细胞系和细胞培养

人胶质瘤U251 和U118 细胞株、鼠胶质瘤GL261 细胞株购自美国模式培养物集存库。细胞培养于37℃、5%CO2的培养箱中，在含10%胎牛血清及100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的Dulbecco’s改良培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）中进行细胞培养，待贴壁生长至90%时使用胰蛋白酶消化传代。

三、CellTiter 实验检测细胞存活率

取对数生长期细胞，按3×103/100 μL 接种于96孔培养板内，每孔100 μL，同时以培养基作为空白对照。37℃、5%CO2条件下过夜，弃原培养基，实验组中分别加入含不同浓度DIM-C-pPhOH 培养基（终浓度为2.5、5、7.5、10、15、20、30 μmol/L），对照组中加入培养基，每组设3 个复孔。培养48 h 后，弃上清液，每孔加入50 μLCellTiter 反应液，避光孵育15 min。酶标仪检测各孔的吸光度（A）值，计算细胞的活性，细胞活性（%）=（实验组平均A 值/对照组平均A 值）×100%。

四、抓痕实验检测U251 细胞迁移能力

U251 细胞以2×104接种于6 孔培养板中，过夜。用无菌的200 μL 移液管尖按标记位置刮出划痕，并用分别含Hoest33342、10 μmol/L DIM-C-pPhOH 且无血清DMEM 培养基培养细胞，保存在CO2培养箱中。分别于0、6、12 h 在荧光显微镜下拍摄划痕。迁移率（%）=（剩余面积值/抓痕面积值）×100%。

五、3D-invasion 实验检测U251 细胞侵袭能力

取对数生长期U251 细胞，细胞以1.5×104/mL、20 μL 每滴接种到6 cm 无菌的培养皿盖上，小心翻转并于培养皿内加入6 mL 磷酸缓冲盐溶液。72 h后收集细胞球并接种96 孔板于含兔血胶原的培养基上。将DIM-C-pPhOH 以10 μmol/L 的浓度加入培养基，分别于0、6、12 h 拍摄细胞侵袭情况。侵袭率%=（细胞总面积-细胞核面积）/细胞核面积×100%。

六、免疫荧光实验

取对数生长期GL261 细胞，细胞以3×103/100 μL接种到玻璃底面96 孔板，过夜，弃原培养基，分别于各孔中加入含5 ng/mL 转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），DIM-C-pPhOH 10 μmol/L及2 种因子都含有的DMEM 培养基50 μL。6 h 后弃去培养基并固定细胞。继续对细胞核、NR4A1 蛋白进行染色后，于激光共聚焦显微镜下观察成像。

七、Western blot 检测蛋白表达

不同浓度DIM-C-pPhOH（5、10 μmol/L）处理U251 细胞12 h 后，收集U251 细胞，用RIPA 裂解液裂解细胞蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测定样本蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳后将蛋白转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入LC3B 抗体（1∶1000）、P62 抗体（1∶1000）、p-Akt 抗体（1∶500）、p-P70s6k 抗体（1∶500）、P70s6k（1∶1000）和β-actin（1∶1000），4℃孵育过夜，次日加入二抗（1∶2000），室温孵育，增强化学发光法发光显色检测。

八、小鼠原位胶质瘤模型治疗

C57 雌性小鼠18 只，4～5 周龄，体质量14～17 g购自北京维通利华实验动物有限公司[实验动物许可证号院SCXK（京）2012-0001]，饲养于温度（21±2）℃，湿度40%～60%，换气通风12 次/h，12 h/12 h光暗交替。小鼠用50 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，将动物俯卧位固定于小鼠脑立体定位仪上。用酒精消毒头皮后，剪开头皮，碘伏清洁切口，暴露颅骨。延前囟后2 mm，旁开右侧1.5 mm，牙科钻打孔。26 号微量注射器手动注射5 μL 细胞悬液（2×105个GL261 鼠源胶质瘤细胞），进针深度3 mm，退针0.5 mm，注射时间约30 s。停针5 min 后，缓慢拔针，消毒缝合切口。模型构建7 d 后，将麻醉以及接种问题死亡小鼠剔除，剩余小鼠随机分成2 组，实验组将DIM-C-pPhOH 溶解于溶剂中，按30 mg/kg 体质量于接种后第7 天开始腹腔注射，对照组以相同剂量注射空白溶剂。分别于7、14、21 d 拍摄颅内肿瘤荧光影像。

九、统计学分析

应用SPSS19.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较用ANOVA单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、DIM-C-pPhOH 可以抑制胶质瘤细胞系的细胞活性

与对照组相比，DIM-C-pPhOH 可以显著抑制3种胶质瘤细胞系（U251、GL261、U118）的细胞活性，并且表现出浓度依赖性（图1）。该化合物作用于3种细胞系48 h，IC50分别为5.76、6.87、9.93 μmol/L。

二、DIM-C-pPhOH 对U251 细胞侵袭和迁移能力的影响

与对照组相比，DIM-C-pPhOH 可明显抑制U251 细胞的迁移能力和侵袭能力。以10 μmol/L DIM-C-pPhOH 处理24 h 后，可以明显抑制U251 细胞迁移，与对照组比，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。与对照组相比，用10 μmol/L 的DIM-C-pPhOH 处理U251 细胞球后6、12 h 均明显抑制其侵袭能力，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图1 不同浓度DIM-C-pPhOH 对于不同胶质瘤细胞系细胞活性的影响

图2 DIM-C-pPhOH 作用12、24 h 后对U251 细胞系迁移作用的影响

三、DIM-C-pPhOH 对NR4A1 基因表达的影响

经5 ng/mL TGF-β 处理后的U251 细胞可以诱导NR4A1 基因的出核表达，同时以TGF-β 5 ng/mL及DIM-C-pPhOH 10 μmol/L 处理后则仅有核内表达（图4）。

图3 DIM-C-pPhOH 作用6、12 h 后对U251 细胞球的侵袭作用的影响

图4 DIM-C-pPhOH 可以抑制TGF-β 诱导的NR4A1 基因出核表达

四、腹腔注射DIM-C-pPhOH 治疗对小鼠胶质瘤模型肿瘤大小以及生存曲线的影响

给药期间，小鼠未见明显消瘦、活动减少及饮食减少。肿瘤荧光影像显示，实验组腹腔注射DIM-CpPhOH 治疗可以减缓小鼠胶质瘤生长，而对照组腹腔注射空白溶剂则小鼠胶质瘤生长较快，但2 组间差异无统计学意义（第2 周：P=0.080；第3 周：P=0.108）。生存曲线分析显示，腹腔注射DIM-C-pPhOH（30 mg/kg）治疗与空白溶剂对照组相比，可以延长小鼠生存期（P=0.019）。具体信息见图5。

五、DIM-C-pPhOH 对U251 细胞蛋白表达的影响

以DIM-C-pPhOH 10 μmol/L 处理U251 细胞24 h后，Western blot 实验发现，DIM-C-pPhOH 可以明显抑制Akt、P70S6K 蛋白表达，从而抑制PI3K/Akt/mTOR/p70s6k 通路，诱导细胞自噬发生，这可能是导致细胞最终死亡的机制（图6）。

讨论

据统计，2018 年有23 880 例新增神经系统恶性肿瘤患者，其中16 380 例死亡。胶质瘤是最常见的恶性脑肿瘤，全球发病率为（0.59～3.69）/10 万，因为涉及多个基因突变，所以成为难以治愈的高侵袭性肿瘤[4-5]。目前新诊断的胶质瘤患者的标准治疗包括手术、辅助放射治疗和替莫唑胺（一种烷基化剂），但疗效有限[6-7]。但高级别胶质瘤具有侵及周围正常脑组织的生物学特性和能力，可以巧妙地避开外科医生的手术刀和根据手术范围进行的放射治疗。这些因为侵袭周围正常脑组织而保留的胶质瘤干细胞亚群是肿瘤复发和进展的主要原因，而且经常表现出对放射治疗和化学治疗的抵抗能力，因此成为了导致患者死亡的主要原因。

孤核受体NR4A1 的表达受多种不同刺激诱导，调节细胞的增殖、存活、细胞周期、迁移和侵袭等，与代谢、神经系统、炎症疾病相关。有研究表明，在胰腺、肺、结肠、肾脏和乳腺癌细胞系中，DIM-C-pPhOH（NR4A1 拮抗剂）通过失活NR4A1 依赖性核前癌通路来抑制细胞生长并诱导细胞死亡[8-11]。

图5 DIM-C-pPhOH 对小鼠胶质瘤模型肿瘤大小以及生存曲线

图6 DIM-C-pPhOH 抑制U251 细胞PI3K/Akt/mTOR/p70s6k 信号通路，诱导细胞自噬发生

细胞自噬有着双重作用，不但有抑制肿瘤形成的作用，同时还可以吞噬降解细胞器，为肿瘤细胞提供能量[12]。Western blot 结果表明，经DIM-C-pPhOH处理过的胶质瘤细胞表现出对U251 细胞PI3K/Akt/mTOR/p70s6k 信号通路的抑制作用并诱导细胞自噬，最终抑制细胞增殖，同时，DIM-C-pPhOH 还可以抑制胶质瘤细胞的迁移及侵袭能力。一项近期的研究显示，TGF-β 可以诱导乳腺癌细胞发生迁移及侵袭，同时该研究表明导致这一现象的根本原因与NR4A1 基因相关[13]。在本研究中，TGF-β 可以诱导胶质瘤细胞中NR4A1 基因的出核作用，而DIM-CpPhOH 则可以抑制这一过程。因此，DIM-C-pPhOH对于迁移以及侵袭的抑制作用可能与其对于乳腺癌的迁移抑制机制相类似[14-15]。

综上所述，NR4A1 拮抗剂DIM-C-pPhOH 可以有效地抑制胶质瘤细胞系的增殖、迁移及侵袭，为临床治疗胶质瘤提供了潜在的可能性。本研究仅初步探索了DIM-C-pPhOH 对于胶质瘤细胞系的抑制作用，提出其作用机制很可能与自噬相关，而其中涉及的生物信号传导通路及具体作用机制仍需进一步深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突