二甲双胍单次和多次给药对大鼠机械通气性脑损伤的影响

颜克实, 王伟伟, 余 鑫, 陆大浩, 戴 晨, 高 巨

(扬州大学临床医学院, 江苏省苏北人民医院 麻醉科, 苏北人民医院麻醉与急危重症研究所, 江苏 扬州, 225001)

机械通气是全身麻醉和急危重症患者的重要治疗措施，但长时间机械通气可导致呼吸机相关肺损伤(VILI), 诱发脑组织炎性改变和神经元凋亡，导致脑损伤及功能异常，其机制可能与炎性因子有关[1-4]。二甲双胍是目前治疗2型糖尿病(T2DM)的有效方法之一，目前已发现二甲双胍可以预防T2DM患者的糖尿病心脑血管病变，降低高危人群的糖尿病发生率[5]。最近研究[6-8]指出，二甲双胍治疗和预防疾病的作用不再限于传统的糖尿病治疗，甚至可抗抑郁，降低癌症风险，延长血糖正常小鼠寿命，延缓衰老。研究[9]表明，单次给予小鼠二甲双胍对脂多糖(LPS)诱导的神经炎症有脑保护作用，也有研究[10]认为多次给药可引起健康小鼠的焦虑和认知功能受损。本研究拟通过建立大鼠机械通气致脑损伤模型，探讨单次及多次给予二甲双胍对该模型的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康成年雄性Wister大鼠24只，体质量200～220 g, 由扬州大学比较医学中心提供。采取随机数字表法将大鼠分为4组，即对照组(C组)、机械通气组(MV组)、机械通气+单次二甲双胍组(MET组)、机械通气+多次二甲双胍组(M-MET组)，每组6只。

1.2 方法

M-MET组实验前喂食二甲双胍500 mg/(kg·d), 持续4周; MET组实验前喂食二甲双胍500 mg/kg, 实验前禁食10 h, 自由饮水。腹腔注射0.7%水合氯醛5 mL/kg麻醉大鼠，麻醉后行气管插管术。按照文献[2]方法制备机械通气致脑损伤大鼠模型。C组保留自主呼吸。MV组、MET组和M-MET组接 DW 3000型小动物呼吸机(安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司)行机械通气。呼吸参数设置: 吸呼比(I∶E)为1∶2, 潮气量(VT)40 mL/h, 通气频率为40次/min, 吸入氧浓度(FiO2)21%, 通气时间6 h。机械通气结束后立即断口处死取脑，冰上快速分离海马并取部分海马组织，置于4%多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋处理，制备病理切片，常规HE染色后光学显微镜下观察海马CA1区组织病理学改变。取剩下的脑组织冷冻并保存在-80 ℃条件下，检测时用低温组织匀浆器制成10%组织匀浆，离心后取上清液采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。使用Bradford蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平均采用试剂盒进行测定。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 大鼠脑组织病理学改变

C组海马组织未见明显病理学改变, MV组与其相比细胞排列散乱、稀疏，细胞间隙增大，神经元数目明显减少且肿胀，胞体不规则，核仁不清，可见核固缩。同MV组相比, MET组损伤明显减轻，神经元层次增加，排列相对整齐致密，间隙较小，神经元数目相对较多，胞体相对规则，核仁清晰。M-MET组病理学改变介于MET组合MV组之间。见图1。

2.2 脑组织IL-6、TNF-α、MDA和SOD水平比较

与C组相比，另3组的IL-6、TNF-α和MDA水平升高，SOD水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05); 与MV组相比, MET组和M-MET组大鼠炎性因子IL-6、TNF-α和MDA水平降低, SOD水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05); 与MET组相比, M-MET组IL-6、TNF-α和MDA水平升高, SOD水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

A: C组; B: MC组; C: MET组; D: M-MET组。

图1 光镜下各组大鼠脑组织病理学改变(放大倍数400倍)

表1 4组大鼠脑组织IL-6、TNF-α、SOD和MDA水平比较

IL-6: 白介素-6; TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; SOD: 超氧化物歧化酶; MDA: 丙二醛。

与C组相比, *P<0.05; 与MV组相比, #P<0.05; 与MET组相比, △P<0.05。

3 讨 论

对很多重症患者而言，机械通气是重要的生命支持手段，但机械通气时肺上皮和内皮水平的机械信号经传导触发生物信号，形成炎症级联反应，炎症介质促进局部组织损伤，甚至可能扩散到脑等其他远端器官和系统，加重甚至诱发肺损伤[11-12]。研究[13]认为，由于平均气道压力增大，淋巴引流减少，机械通气可能会损害局部血流和大脑氧合，尤其是长期进行机械通气的患者可能出现记忆认知改变。因此，抑制炎症及应激则会改善机械通气造成的脑损伤。本研究中，炎症因子的增加和氧化应激标志物的变化与机械通气后大脑组织病理学改变的程度相符，印证了炎症与机械通气致脑损伤有密切相关性。

大量研究[9, 14]证实二甲双胍对脑具有神经保护作用，二甲双胍可保护血脑屏障，减少内毒素LPS致脑损伤，抑制活性氧(ROS)产生，其机制可能与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活和核因子κB(NF-κB)的抑制相关。另一项研究[15]显示，二甲双胍可以通过抗炎、抗氧化作用，激活PI3K/Akt信号通路来保护小鼠的大脑皮质、纹状体和海马的神经元从而减少败血症的侵害。本研究结果表明，二甲双胍减轻了机械通气诱发大鼠脑损伤的机制与抑制氧化应激，降低炎性因子水平相关。

二甲双胍作为AMPK激动剂，抑制细胞氧耗，减少ATP产生。研究[16]表明，多次或大剂量二甲双胍处理，糖酵解ATP产生中的作用无法补

偿二甲双胍对线粒体氧化磷酸化的抑制作用，最终改变代谢信号，抑制炎性因子能力减弱，损伤海马组织，且二甲双胍的生物利用度随着剂量的增加而逐渐降低并发生膜转运蛋白饱和，因而脑保护作用不会随着服药时间以及剂量的累积而增加，甚至可能有相反的作用。本研究结果显示, MET组对炎性因子及氧化应激的抑制能力以及脑保护作用优于M-MET组。

综上所述，二甲双胍可减轻机械通气诱发的大鼠脑损伤，其机制可能与抑制炎性通路和氧化应激有关，且单次给药的效果优于多次给药。