基于SSR标记的芍药种质资源遗传多样性研究

李珂楠，杨成龙2，范竟超

(1.河南省商丘医学高等专科学校，河南 商丘 476000；2.贵州省农业科学院亚热带作物研究所，贵州 兴义 562400)

芍药(Paeonialactiflora)，别名将离、余容、婪尾春、犁食，属于芍药科芍药属草本或木本多年生植物。芍药属植物在中国分布广泛，有16个野生种在我国南北有分布，而且还有数百个芍药栽培品种分布。芍药是中国的传统名花之一，耐寒冷，不耐涝，喜冷凉天气，与“花中之王”牡丹齐名。芍药栽培管理粗，适应性强，且属药用兼观赏类植物，为切花和园林绿化的优良花卉植物种类。目前，在安徽亳州、河南洛阳等地已逐渐发展栽培、研究中心，并形成了规模化商品性生产；而在美国、加拿大、新西兰等国也有芍药的栽培和应用。

芍药之名首载于《神农本草经》，已有3000多年的栽培历史。《神农本草经》称芍药可“止痛”，能治“邪气腹痛，除血痹，破坚积”。张仲景《伤寒论》芍药甘草汤宗《素问。阴阳应象大论》：“肝苦急，急食甘以缓之”之则。芍药配甘草，酸苦甘温相合，化阴和血，濡养筋脉，其突出的功能就是舒挛止痛。中医中将芍药分为白芍和赤芍：白芍中医主要治疗头晕、肢体痉挛、自汗和月经不调等症状；赤芍主要用于清热凉血、活血祛瘀等疗效。此外，芍药与其他中草药复配使用，如芍药甘草汤、八珍汤、芍药甘草附子汤、当归芍药散等。据报道，芍药苷对蜂毒引起痛觉具有明显的缓解效果，对其引起的继发性痛觉过敏，原发性痛觉过敏表现出明显的治疗效果，对抑制镜像热过敏的发生有明显作用。研究表明，芍药苷药理作用主要具有镇痛、镇静、抗惊厥作用；抗血小板聚集作用；解痉作用；扩张血管作用和抗血栓形成的作用；抗炎、抗溃疡和抗过敏的作用；调节免疫力作用等。因此，被世界许多国家广泛用作中药材和保健类食品。

目前，国内外科研工作者在芍药资源的遗传多样性、形态多样化、起源与进化等方面做了大量研究工作。在形态、细胞、生理生化、叶绿体、抗性和分子标记开发等方面有深入研究，但对于芍药种质资源，尤其是野生种质资源缺乏系统深入的研究。充分发掘华中地区芍药种质资源，培育专用型新品种，针对不同用途都要基于了解该区域芍药的遗传背景，但对于其起源、物种形成、分化等进化过程不清楚。本研究将基于SSR标记对华中地区芍药种质资源进行遗传多样性以及亲缘关系的研究，从而为华中地区芍药种质资源的有效保护与开发利用提供参考，为芍药重要性状的分子育种和培育新品种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

芍药种质资源由河南省商丘医学高等专科学校芍药课题组于2017年分别在河南省、湖北省、安徽省等不同地区采集获得(表1)，基本覆盖了3省的芍药主栽区域，本试验在河南省商丘市虞城县界沟镇王桥村芍药资源圃进行。

表2 引物信息

表1 材料来源

1.2 芍药基因组DNA提取

利用改良的CTAB法提取各个芍药资源总DNA，称取0.5 g样品进行提取总DNA。

1) 将CTAB 提取液置于65 ℃水浴锅中预热30 min。

2) 取0.5 g样品加入液氮迅速研磨，加入2 mL预热的CTAB提取液，置于65 ℃温育30 min，每隔5～10 min颠倒混匀，然后冷至室温。

3) 于12 000 r·min-1，4 ℃，离心5 min，将上清液转移到新离心管。

4) 加入等体积酚/氯仿(1∶1)，涡旋使其充分混匀，12 000 r·min-1离心15 min，取上清转入另一新离心管。

5) 加入等体积氯仿，涡旋使其充分混匀，12 000 r·min-1，离心15 min，取上清转入另一新离心管。

6) 重复步骤4)，5)1次。

7) 加入等体积的异丙醇混匀，室温放置15 min，每隔5 min轻轻颠倒混匀。

8) 12 000 r·min-1，离心15 min，弃上清。

9) 将沉淀用70%的乙醇漂洗1次，12 000 r·min-1，离心10 min，弃上清，重复洗1次。

10) 倒掉废液，12 000 r·min-1，4 ℃，空离心1 min。

11) 将沉淀用30μL TE溶解；

12) 取少量的DNA用于1%琼脂糖凝胶电泳，OD值测量，检测RNA的完整性和浓度，其余置于-70 ℃冰箱中保存备用。

1.3 PCR 扩增与检测

1) PCR反应体系。

SSR引物体系(共20μL)：稀释20倍模板DNA 2μL；10×Buffer 2μL；10 mmol·L-1dNTPs 0.4μL；5 U·μL-1Taq酶0.2μL；Eprimer 1μL (20μmol·L-1)；Mprimer 1μL (20μmol·L-1)(见表2)。

2) PCR反应采用如下循环参数。

SSR PCR扩增程序：混匀后于PCR仪上扩增，按以下程序扩增：95 ℃，5 min；95 ℃，35 s，65 ℃，35 s(每循环降低0.7 ℃)，72 ℃，1 min， 循环数为12个；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，1 min，循环数23个，72 ℃，5 min，反应结束后于4 ℃保存。

3) 引物信息。

从15对引物中筛选了8对引物进行批量SSR检测。

每对引物的扩增产物随机抽取样品，取3μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 数据分析

将从测序仪上扩增得到的原始数据96个样品、8对引物组合扩增产物利用GeneMarker 2.2软件进行生物信息学分析，通过比较各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置后，可以获得大小不等的扩增片段信息。再根据条带的有无转化为0，1数据矩阵。通过对引物多态性的百分率与多态性信息指数(PIC)的计算，PIC=∑(1-pi2)/n，其中，pi为任一引物组合第i条多态性带在所有供试材料中出现的频率；n为供试材料的总数。利用popgene软件和NTSYS软件对样品进行遗传多样性分析。利用POPGENE 32计算各个居群的多态位点百分比(PPL)；遗传多样性指数(Nei’s)；Shannon’s指数(Ⅰ)等；采用NTSYSpc 2.11软件进行UPGMA聚类分析。

表3 100份芍药试材SSR引物组合特征信息

图1 基于Nei的遗传距离的Neighbor-Joining聚类分析

2 结果与分析

2.1 SSR引物多态性分析

基于SSR技术对100份芍药资源多态性进行评价，PCR扩增结果中平均每对引物扩增6条不同条带，所有样品共扩增出54条不同条带。100份芍药资源中平均有效等位基因位点数为6.75，其Shannon信息指数为1.174。观察的100份资源杂合度为0.097 8(P 5)～0.989 6(P 55)，期望杂合度为0.209 5(P 5)～0.865 2(P 16)；100份芍药资源中每对引物组合扩增条带结果范围为4～11条，其中，P 44可扩增出11条，为扩增带数量最多的引物。而P 16引物的扩增出的结果的多态性指数最高，观察扩增结果的杂合度为0.989 6，扩增芍药资源的期望杂合度0.865 2，100份芍药资源中有效等位基因位点数为7.174 1，其引物对100份芍药资源的扩增Shannon信息指数2.132 6(见表3)。

2.2 芍药遗传相似系数与遗传距离

100份芍药种质资源中，除去遗传距离为0的材料，可能为同一个种质，遗传距离范围在0.200 7～1.700 6之间，其中1与4两份资源的遗传距离最大，达到1.700 6；而8、11、20、21、22、24、25、28、32、33、52、75、76、78、79、82、84、85、87、89、91与9 722份资源以0.200 7达最小遗传距离，说明为同一个资源。材料间相似系数(GS)变异除了0和1外，相似系数变异范围为0.120 1～0.957 4之间，平均GS为0.538 6；芍药资源20与132遗传相似系数高达0.957 4，可能为同一份资源；从遗传相似系数分析可见，芍药种质资源的遗传相似系数较小，说明芍药种质资源的遗传变异较大(图1)。

2.3 基于遗传相似系数的芍药种质材料聚类分析

根据芍药种质材料间的遗传相似系数，合并相同的资源对96份供试材料进行聚类分析(图1)。当遗传相似系数为0.488时，96份芍药种质资源在遗传聚类上被分为3大类，其中104、105、106种质资源为第Ⅰ类群；2、18、59和60为第Ⅱ类群；其他为第Ⅲ类群。第Ⅲ类群又分为Ⅲ-A、Ⅲ-B、Ⅲ-C亚类，其中Ⅲ-A亚类由资源4、6和17组成；Ⅲ-C亚类由资源1、26和69组成，其他资源共同组成Ⅲ-B亚类。在聚类图中，96份芍药资源为华北各地区的材料，从聚类图中可以看出各地的资源存在着交互流通作用。

3 讨 论

3.1 SSR分子标记与芍药种质资源的多样性

本研究采用100种芍药种质资源，分别于河南、安徽、湖北收集与自育芍药新材料，其各份资源间均具有代表性。说明在揭示芍药种质材料遗传变异方面SSR标记效率较高。

随着分子生物学的发展，目前国内针对SSR标记芍药遗传多样性分析的研究不多，可见对芍药资源用SSR标记较RAPD标记具有一定高效性。

3.2 聚类分析在芍药种质资源遗传多样性评价的优势

本研究根据芍药种质资源间的相似系数对100份供试材料进行了聚类分析，结果表明，100份种质的遗传相似性系数值变异在0.120 1～0.957 4之间。实验证明，使用聚类分析能有效揭示芍药种质间的亲缘关系，更有利发现新的遗传变异。

随着芍药产业的崛起，关于芍药生物学研究也在逐年增多，利用分子标记开展对芍药种质资源的多样性研究以及芍药与牡丹等植物的亲缘关系方面已有较为全面的研究，采用SSR标记不但能为芍药资源收集、评价利用与保护提供重要的理论参考，还可以为分子标记辅助育种提供强有力的理论支撑。华中地区蕴含丰富的芍药资源，具生态多样性，本实验样品采集数量有限，应扩大芍药居群的遗传多样性分析。综上所述，采用SSR标记方法可为今后芍药种质资源创新利用和多样性的研究提供更为准确的参考。