响应曲面法优化微波提取花生壳中总黄酮工艺研究

崔建强,问娟娟

(陕西国际商贸学院 医药学院, 陕西 西安 710246)

花生是豆科植物(Arachis hypogoea L)我国主要的油料作物之一，这种植物的很多部分都含有对人体有益的物质，例如花生仁、花生壳、花生叶等。通常我们处理花生植物主要使用的是花生仁，它本身可以食用，也可以用于榨油、磨粉等。花生壳除了少数被利用外，绝大部分废弃掉或当做燃料[1]。其实花生壳中含有很多有益的物质，研究[2-3]表明，其提取物有抗癌、抗炎、抗氧化等作用，能够产生这些作用主要是花生壳中含有黄酮类化合物的影响。因此，如何把黄酮类化合物从花生壳中提取出来对开发新药具有重要的实用价值和学术意义。现如今，提取总黄酮方式的很多，传统提取法(水浸取法、索氏提取法等)有一些弊端，例如耗时、耗能、提取率低等[4-6]。为了改善这些不足，笔者使用微波辅助萃取法，是近几年天然产物提取中使用较多的提取方法之一，其在能耗、时间、选择性等方面对比传统方法有很大的提高[7-8]。为了提高收率，采用单因素实验结合响应曲面优化，得到较优提取条件，为花生的综合利用提供科学理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

花生壳，市售；芦丁标准品，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇，天津市北联精细化学品开发有限公司；石油醚(沸点60-90)，天津科密欧化学试剂有限公司；二次蒸馏水。微波催化合成/萃取仪,北京祥鹄科技发展有限公司；粉碎机GY-753，天津市泰斯特仪器有限公司；紫外一可见光度计，天津精密科学仪器有限公司。

1.2 花生壳中总黄酮提取及含量测定

花生壳洗净，于干燥箱恒温干燥，水分蒸发完全，使用粉碎机将其粉碎完全，过40目筛备用，加入石油醚脱脂两次，然后进行抽滤，取滤渣进行干燥，备用。

取花生壳粉末，精密称取1.0 g，并将其加入到规格为50 mL的烧杯中，分别在不同的乙醇浓度、微波功率、提取时间和液料比因素下提取，然后抽滤，用旋转蒸发仪进行旋转制成浸膏，按照配比加入乙醇溶解，用离心机进行离心，得到的溶液定容到容量瓶中，再进行稀释，配成待测溶液，测定其吸光度，计算收率。

1.3 总黄酮收率测定

测定总黄酮收率采用紫外分光光度法，制备单因素实验所得样品的供试品溶液。测量其吸光度，计算获得收率。

线性回归方程：A=10.542C-0.1386，相关系数R2=0.9982。(C：代表浓度 A：代表吸光度)

花生壳中总黄酮收率=(d·C·V/1 000 M)×100% (d：稀释倍数 C：测得的总黄酮的浓度(mg·mL-1)V：提取液体积(mL) M：代表花生壳样品的质量(g))

1.4 单因素实验

分别考察乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%；液料比为5∶1 mL·g-1、10∶1 mL·g-1、15∶1 mL·g-1、20∶1 mL·g-1、25∶1 mL·g-1；微波功率为200 W、300 W、400 W、500W、600 W；微波提取时间为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min等条件对总黄酮收率的影响。

1.5 响应面优化实验

由单因素实验结束后，进一步对单因素四个实验条件考察，以总黄酮收率为响应指标，应用Design-Expert8.0.6软件，优化实验条件。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

通过图1可知,总黄酮的收率在乙醇浓度为60%、微波功率400 W、时间50 min、液料比10∶1 mL·g-1的条件下最大。

2.2 响应曲面法优化试验

2.2.1 响应面分析因素水平的选取

表1 响应面试验设计条件

2.2.2 总黄酮得率回归模型的建立和显著性检验 根据相应的试验方案进行试验，试验分析方案及结果见表2。

通过Design-Expert8.0.6软件，对响应值和各个影响因素进行了拟合，之后，就得到了回归方程：

花生壳中总黄酮收率(%)

=+3.81+5.833×10-3A+0.029B+0.044C+0.057D-5.000E-003AB-0.033AC+0.015AD-0.025BC+0.043BD-0.030CD-0.063A2-0.18B2-0.15C2-0.10D2

表2 Box-Behnken设计及响应值结果

续表2 Box-Behnken设计及响应值结果

表3 方差分析

注：＊＊表示极显著，＊表示显著。

从表3中可以得出，B、C、D、AC、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2对花生壳中总黄酮的收率存在不同程度影响(显著或极显著)，故证明不同影响因素与响应值总黄酮收率之间显示出比较明显的非线性关系。此外，从表3中可知该回归模型极显著；失拟项(F=16.67，P=0.0215)不显著，说明该模型的模拟性较好。由式(R2=0.9875)可知，模型具有高度显著水平，此方程的决定系数R2adj=0.9750,代表97.50%响应值的改变可由改模型解释。综合而言，此次针对总黄酮提取率与其各影响因素建立的回归模型合理，适应性好。

分析乙醇浓度、微波功率等四个因素对花生壳总黄酮收率的影响，结果见图5。

(a)乙醇浓度与提取功率的交互作用 (b)乙醇浓度与提取时间的交互作用 (c)乙醇浓度与液料比的交互作用

(d)提取功率与提取时间的交互作用 (e)提取功率与液料比的交互作用 (f)提取时间与液料比的交互作用

图2 等高线图和三维图

由图2中的3D响应面开口，并且都是向下，指示A(乙醇浓度)，B(提取的功率)，C(提取时间)，D(液料比)与花生壳中总黄酮收率具有抛物线关系，可知与BC、BD、CD均存在一定交互作用，因为从趋势图来看，都呈圆形趋势，且趋势线连接的并不紧密；但与BC、BD、CD相比，AB、AC、AD都呈椭圆形趋势，且趋势线连接的较紧密；交互对花生壳中总黄酮的收率具有显著影响。

2.2.3 最优提取工艺选择及可靠性验证 根据响应面图得出的最佳实验方案是：乙醇浓度58.63%，提取功率401.88 W，提取时间52.06 min，液料比11.03 mL·g-1，当实验在最优提取工艺以及最佳工艺条件下的预收率为3.82206 %。将实验系数修正为乙醇浓度60 %，提取功率400 W，提取时间50 min，液料比10：1mL·g-1，以最优工艺条件提取，设三次重复，得出花生壳总黄酮平均收率为3.807 %，接近预测值。因此，此响应面模型较为合理，为以后这方面的研究提供参考。

3 结论

笔者以花生壳为材料，通过对花生壳的前处理，微波方式提取花生壳中的总黄酮，运用紫外分光光对法对其含量测定。在提取的过程中根据单因素的分析以及响应曲面法的优化，得出当液料比为10∶1 mL·g-1时，在浓度为60 %的乙醇中，以400 W的提取功率提取50 min为最佳工艺条件。