桐花树内生和根际细菌多样性及抗血栓活性研究

李菲 黄庶识 胡文进 李喆 黄媛林 王巧贞 潘信利

摘 要：红树植物内生菌在红树共生体的物质循环、能量传递和健康维护等方面起着重要作用。为探究红树植物内生菌的多样性，进一步揭示内生菌在红树共生体的功能多样性提供菌种资源，该研究选择6种分离培养基和采用传统稀释涂布法对从广西北海滩涂上采集的桐花树组织和根际土壤样品进行分离，对获得的可培养细菌进行多样性分析，并通过体外溶栓实验筛选出具有抗血栓活性的菌株。结果表明：（1）基于16S rRNA基因序列系统进化分析，从桐花树组织和根际土壤中共获得125株细菌;分布于变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）3个门27个科39个属74个种中，芽孢杆菌属为优势菌属，菌株数量占13.5%。（2）抗血栓活性实验表明，初筛获得18株具有抗血栓活性细菌，总阳性率为24.32%;将初筛有活性的菌株进行复筛和重复验证实验，进一步验证其活性，结果复筛出3株细菌B1850、B1989和B2632具有很强抗血栓活性。综上所述，广西北海滩涂上红树植物桐花树中存在丰富的可培养细菌资源，具有从中挖掘新的纤溶酶和开发溶血栓药物的潜力。

关键词：桐花树，内生细菌，根际细菌，多样性，抗血栓活性

血栓性疾病是一类严重威胁人类健康的常见病、多发病，常表现为心绞痛、心肌梗死、脑栓塞和脑梗死等，多以中老年人为主要发病群体，现发病人群逐渐趋于年轻化，且发病率与死亡率在不断上升（乔德水等，2009;Jremo et al.，2013）。血栓性疾病的起因主要是血管腔中形成血栓使其变得狭窄或闭塞，导致主要器官缺血或梗死。而血栓是人体内血液组成成分在血管或心脏内形成的凝块，可脱落凝块随血液流至远端，从而堵塞血管腔（Sun et al.，2008）。目前临床上主要有三大类治疗血栓性疾病的药物，即抗血小板类、抗凝血类和溶血栓药物。传统的溶血栓药物在临床上虽具有确切的疗效和良好的安全性，但其存在的半衰期短、纤维蛋白特异性低和价格贵等缺点也不容忽视（翁郁华等，2010）。因此，寻找能解决上述问题的溶血栓药物具有广泛的应用前景。

近年来，海洋微生物是新型纤溶酶的重要来源之一。Lakshmi et al.（2013）从海洋沙雷菌（Serratia sp. RSPB11）分离到一种具有纤维蛋白水解活性和高热稳定的碱性金属蛋白酶。李占强等（2009）从南海沉积物中分离到的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus B5815），其纤溶酶活性好且产酶量高。Huang et al.（2013）从海洋枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis HAS-3）分离到一种纤维蛋白水解酶。刘晨光等（2001）分离到一株海洋假单胞菌（Pseudomonas sp.）可产生较强的直接溶解纤维蛋白和具有抗血栓活性的碱性蛋白酶MPAP。这些为从海洋微生物来源寻找抗血栓的药物提供了很好的依据。桐花树系红树林中广布种之一，广泛分布于亚洲至大洋洲热带海岸，在我国的广东、广西、福建和海南等省（区）均有分布（缪绅裕等，2007）。我国的桐花树由于受到常年全日潮水的浸淹，使之生长状况、营养发育、生物量分配、激素水平和相关酶系等方面的生理生态性质表现出梯度性反应（何斌源等，2007），其内生菌长期生活于植物体内的特殊环境中并与之协同进化。植物体为其提供生长所必需的能量和营养的同时，内生菌又会通过自身的代谢、信号传导对植物体产生响应（文才艺等，2004）。本研究以广西北海滩涂的桐花树中分离、培养和鉴定出的植物内生和根际细菌为样本，旨在筛选出具有高效抗血栓活性的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样本来源 桐花树于2018年8月在广西北海滩涂（108°50′42″ E、 21°55′25″ N）采集。样品装于密封袋，4 ℃低温保藏带回实验室，尽快完成前处理和分离工作。

1.1.2 羊血实验试剂 无菌脱纤维羊血（初筛羊血）和抗凝羊血（复筛羊血），均购买于南宁茂接微生物科技有限公司。阳性对照药物：血塞通片（云南维和药业股份有限公司），购买于一心药业。

1.1.3 培养基

（1）分离培养基：AGG、M5、P7、M10、M4和P3，详情信息见表1。

1.2 菌株的分离纯化

1.2.1 样品预处理 参照李菲等（2018）预处理方法，代表性地选择桐花树各组织进行细菌的分离实验。首先，用5%次氯酸钠溶液浸泡3～5 min，用无菌水冲洗多次;其次，用0.2%吐温20溶液浸泡10 min，用无菌水冲洗多次;最后，用75%的酒精溶液浸泡5 min，用无菌水冲洗多次。消毒后的组织样品，分别用无菌手术刀进行切碎;取约1 g的样品进行充分研磨，加入9 mL无菌水与样品混匀，即为初始的组织悬液，再依次稀释到103和104的组织悬液，待用。

桐花树根际样品的收集，轻轻刮下根须表面附着的土壤，平铺于无菌平皿中，经65 ℃热风干燥30 min。称取2.0 g样品装于20 mL无菌水中摇匀;制成102和103稀释度的样液，待涂布处理。

1.2.2 细菌的分离纯化 取200 μL梯度稀释的样液接种于6种复合营养培养基中，28 ℃培养数周，并及时观察菌株的生长情况，挑取肉眼可见菌落进行纯化培养，记录其形态特征和相同菌落数，以30%（V/V）甘油-ISP2混合液作为保护剂，将纯化好的菌株制成凍存管保藏于-70 ℃。

1.3 16S rRNA系统发育分析

采用Chelex-100树脂（周双清等，2010）快速提取细菌的DNA作为PCR模板，并根据Walsh（1991）的方法对其进行PCR扩增。引物为27F和1522R，参照李菲等（2018）的方法设定PCR反应条件。扩增产物经1%琼脂糖-TAE凝胶电泳检测合格后，委托北京擎科新业生物技术有限公司进行测序分析。序列经BioEdit Sequence Alignment Editor软件整理后，利用EzTaxon服务器进行在线比对（Kim et al.，2009）;以同源性最高菌株的有效序列作为参比对象，构建Neighbor-Joining系统发育树，各分支置信值检测设为Boostrap1 000次，对各菌株的系统发育地位进行分析（Li et al.，2017）。

1.4 细菌对抗血栓活性的筛选

1.4.1羊血培养基制备 以改良ISP2固体培养基为基础培養基，121 ℃高温蒸汽灭菌20 min。待培养基冷却至55 ℃，添加10%脱纤维无菌羊血，摇匀后倒入无菌平皿中，待平皿静置冷却2 h后，待用。

1.4.2 初筛 首先将排重后的74株细菌，分别接种至ISP2固体培养基上，取生长对数后期的细菌划线至羊血培养基上，每板划4株细菌，置于28 ℃的恒温培养箱培养。然后于24 h后观察平板上微生物的生长情况，观察是否有透明圈，颜色变化等。再将产生明显透明圈的菌落划线至ISP2固体培养基上，供复筛用。

1.4.3 复筛 参考辛宏等（2018）的方法制备人工血栓，取300 μL脱纤维无菌羊血，至于灭菌西林瓶底部，加入9 μL 1 mol·L1的CaCl3溶液，放置10 min，待血液凝固使用。

将初筛结果良好的16株细菌，分别接种于50 mL改良的ISP2液体培养基上，28 ℃，180 r·min1摇床培养7 d;取出发酵液，8 000 r·min1离心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔滤膜除菌，获得抗血栓活性待测液;取2 mL待测液沿壁缓慢加入凝固的人工血栓中，以2 mL ISP2液体培养基和2 mL 0.7%生理盐水作阴性对照，以2 mL 0.173 g·mL1血塞通片（含三七总皂苷含量为100 mg）为阳性对照。放入28 ℃培养，每隔24 h观察一次血凝块溶解情况，并轻微晃荡，记录结果。

2 结果与分析

2.1 桐花树中内生及根际细菌多样性分析

根据菌落的形态、颜色和大小等特征进行排重，选取125株细菌进行测序对比分析，获得74种细菌，其中桐花树各组织中获得34种内生细菌，隶属于18科22属;根际细菌44种，隶属于20科27属。分别对桐花树的内生细菌和根际细菌构建N-J系统进化树（图1和图2）。

2.2 不同培养基对内生和根际细菌的分离效果

采用6种培养基，从桐花树中分别获得内生和根际细菌71株和64株;经形态法和16S rRNA基因序列对比排重后，获得74株细菌在6种培养基上分离效果（图3）。根据其分离效果分析：P3和P7培养基分离到细菌种类最多，均有17个菌属;AGG培养基分离的细菌种类最少，包含4个菌属，究其原因可能是AGG培养基主要成分为淀粉，较适合优势放线菌群（链霉菌属）。由菌落数统计结果可知，M10、M5、AGG、 M4、P7和P3培养基上菌落数分别为4.3、3.1、1.2、7.3和7.2（×105 cfu·mL1）。P3和P7培养基分离效果相近，获得的细菌均隶属于17属，其菌种数和多样性均较高;而AGG培养基获得的细菌均隶属于5属，故其获得较少的细菌数和多样性。

2.3 内生及根际细菌的属级水平上的韦恩图分析

在属级水平上对桐花树各组织和其根际来源细菌进行venn分析，结果显示，从桐花树各组织和根际中获得细菌种类存在较大的差异，桐花树内生细菌和根际细菌共有10个相同的菌属，分别为Novosphingobium sp.、Sphingomonas sp.、Gordonia sp.、Micrococcus sp.、Streptomyces sp.、Pseudomonas sp.、Mycolicibacterium sp.、Mycobacterium sp.、Bacillus sp.和Microbacterium sp.。对桐花树各组织与根际来源的细菌分别进行venn分析，仅有一个共同的芽孢杆菌属（图4：A）;根部分离的细菌与根际细菌有8个共同菌属（图4：B），其他各组织分离的细菌与根际细菌的种属相差较大。

2.4 细菌抗血栓活性初筛

将初筛的羊血平板放置28 ℃培养24 h后，观察细菌生长和晕圈情况。结果显示，筛选74种细菌的抗血栓活性，有18种细菌显示出良好的抗血栓活性，总阳性为24.32%;分别隶属于Bacillus sp.、Curtobacterium sp.、Demequina sp.、Kineococcus sp.、Pseudomonas sp.和Sphingomonas sp.。图5显示，B2061、B2635和B1820显示无晕圈，即判定为无溶血活性;B1502、B1500和B1850显示出深色晕圈，B1989、B2634和B2632表现为透明圈，两者均判定为具有溶血活性。

2.5 细菌上清液对体外血栓的影响

根据上述抗血栓活性初筛结果，对18株有活性菌株进行抗血栓活性复筛。图6结果显示，24 h后，B1850、B1989和B2632的上清发酵液将凝血块全部溶解。其余细菌的上清液与血凝块均有明显分层，凝血块较空白对照组的均有变小，上层溶液呈现出红色，故展示出微弱的溶血活性，ISP2培养基和生理盐水空白组中凝血块均维持原样，下层为凝血块，固液分界线清晰。

3 讨论与结论

红树植物是生长在热带和亚热带潮间带河口地带的耐盐植物，分布在30° S与30° N之间。面对高度盐渍化、土壤缺氧、高光辐射、高矿物组成、强还原性和频繁的潮汐等生境特征，红树植物对生长所需营养和空间的竞争变得十分激烈，这一特殊生境丰富了红树林植物内生菌多样性，也必然能代谢出区别于其他生态系统的良好生物活性物质（周婧等，2019）。据报道，红树植物内生菌具有良好的抑菌、杀虫、细胞毒、胞外酶活、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等生物活性（刘伟等，2012;魏华等，2012;李菲等，2016）。桐花树作为传统的中药，其树皮和树叶均有治疗哮喘、糖尿病和风湿等疾病功效，现代药理研究发现其具有明显的抗植物病原菌和细胞毒活性等作用（徐佳佳等，2006），故研究桐花树内生菌的多样性和生物活性获得不少研究工作者的青睐。为了完善桐花树中内生细菌分布情况、物种多样性及其生物活性等信息，本研究选择广西北海滩涂上红树植物桐花树各组织和根际进行细菌多样性分析。采用6种分离培养基，对桐花树组织中获得的内生细菌进行定量分析，共获得34种细菌，隶属于18科22属;从根际中分离可培养细菌44种，隶属于20科27属。从桐花树各组织中获得内生细菌在种类和数量均有明显差异，其中，根部和皮部中分离的细菌种类和数量最多，花和叶中分离到的细菌均较少;而根部来源的内生细菌与根际细菌存在较多相同属。研究发现，根际微生物的分布与沿根的可溶性碳的分布距离有关，其生物量的积累有赖于根系分泌物的释放，从而影响着根际微生物的代谢和生长发育（朱丽霞等，2003）。

采用无菌脱纤维羊血，通过体外溶栓实验筛选出具有抗血栓活性菌株。结果显示，初筛得到18种具有抗血栓活性的菌株，總阳性为24.32%;通过抗血栓活性复筛，从中获得3株具有良好抗血栓活性菌株。该3株强抗血栓活性菌株B1850、B1989和B2632分别隶属于Microbacterium sp.、Stenotrophomonas sp.和Bacillus sp.。据报道，目前已从芽孢杆菌属、链霉菌属、链球菌属、单胞菌属及葡萄球菌属等细菌中分离出抗血栓活性物质（Lack，1948;张艳等，2000），但对海洋来源的微生物在抗血栓活性研究领域上的报道寥寥可数，本文开展海洋来源细菌中抗血栓活性研究，发现两个未见报道的具有良好抗血栓活性菌株Microbacterium sp. B1850和Stenotrophomonas sp. B1989，这丰富了海洋微生物在抗血栓活性研究上的认识，也为寻找新的纤溶酶和研发抗血栓活性药物等下游工作奠定了基础。

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（责任编辑 周翠鸣）