胃腺癌中WWOX和ABCG2的表达及其临床意义

田 静，李学敏，吴莉莉，代 群，张 湛

2018年全球新增胃癌患者约100万人，死亡约78.3万人[1]，其中中国至少有一半的新发胃癌患者和死亡病例[2]。胃腺癌约占胃癌总数的90%[3]。WW结构域氧化还原酶(WW domain-containing oxidoreductase, WWOX)最初是在乳腺癌中发现的抑癌基因。WWOX基因的突变方式主要为半合子和纯合子缺失[4]，导致其表达异常降低，与肿瘤组织的浸润、转移及复发等密切相关[5-6]。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)是指一小群具有自我更新、不对称分裂及诱导分化、侵袭、转移及抵抗放、化疗的细胞[7]。三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G亚家族成员2(ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)是三磷酸腺苷结合盒转运蛋白家族重要成员，可以促进CSC的侧群细胞形成[8]。目前，关于WWOX和ABCG2的关系尚未见报道。本文主要通过免疫组化EnVision法检测112例胃腺癌组织中WWOX和ABCG2蛋白的表达，分析其与胃腺癌的浸润、转移及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2010年1月～2018年12月合肥第三人民医院病理科和肥西县人民医院病理科胃腺癌组织标本112例(术前未行任何抗肿瘤治疗)和相应的癌旁(>5.0 cm)正常胃黏膜组织60例作为对照。所有胃腺癌患者均有完善的临床病理资料和随访资料，入选病例随访至患者死亡或截止2019年3月。随访时间4～83个月，中位时间为49.1个月。年龄28～75岁，中位年龄55.3岁。

1.2 试剂兔抗人多克隆抗体WWOX和鼠抗人单克隆抗体ABCG2，均购自美国Abcam生物公司；EnVision和DAB显色试剂盒，均购自北京中杉金桥公司。

1.3 方法标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续4 μm厚切片，在二甲苯及梯度乙醇溶液中连续脱蜡至水洗。WWOX和ABCG2蛋白的染色步骤按试剂盒说明书进行，用已知阳性片作阳性对照，采用PBS液代替一抗作空白对照。

1.4 结果判定WWOX主要以细胞质内呈黄色或棕黄色颗粒为阳性，细胞膜也可以着色；ABCG2主要以细胞膜和细胞质内呈黄色或棕黄色颗粒为阳性。阳性判定主要根据免疫组化染色的着色强度和阳性细胞百分数乘积计分[9]，若乘积≥3分判定为阳性，<3分判定为阴性。免疫组化染色结果判定由两位高年资病理医师通过双盲法独立阅片。

1.5 统计学分析数据经SPSS 20.0软件进行统计学分析。WWOX和ABCG2蛋白表达与胃腺癌中临床病理参数及相关性采用χ2、Spearman等级相关检验；应用Kaplan-Meier法分析WWOX和ABCG2阳性组和阴性组患者术后总生存时间，组间比较采用Log-rank法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃腺癌中WWOX蛋白表达WWOX蛋白在对照组中的阳性率为91.7%(55/60)，在胃腺癌组中的阳性率为42.0%(47/112)，WWOX蛋白的表达差异在两组之间有统计学意义(P<0.001，图1A、B)。进一步分析发现，随着胃腺癌组织的分化越差、TNM分期越高，WWOX蛋白的阳性率越低，差异有统计学意义(P<0.05)；淋巴结转移组中WWOX的阳性率显著低于淋巴结无转移组。WWOX蛋白的表达与胃腺癌患者年龄、肿瘤位置、大体类型、大小及吸烟和饮酒，差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。

2.2 胃腺癌中ABCG2蛋白的表达ABCG2蛋白在对照组中的阳性率为8.3%(5/60)，在胃腺癌组中的阳性率为59.8%(67/112)，两者差异有统计学意义(P<0.05，图1C、D)。ABCG2蛋白表达与胃腺癌患者性别、年龄、肿瘤位置、大体类型、大小及吸烟和饮酒，差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。随着胃腺癌组织的分化越差，ABCG2蛋白的阳性率越高，差异均有统计学意义；淋巴结转移组中ABCG2蛋白的阳性率显著高于淋巴结无转移组；TNM高分期组中的ABCG2蛋白的阳性率显著高于TNM低分期组，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 A. WWOX在对照组中呈阳性，EnVision法；B. WWOX在胃腺癌中呈阴性，EnVision法；C. ABCG2在对照组中呈阴性，EnVision法；D.ABCG2在胃腺癌中呈阳性，EnVision法

2.3 WWOX和ABCG2蛋白表达的相关性Spearman等级相关分析显示，在胃腺癌组中WWOX与ABCG2蛋白的表达呈负相关(r=-0.558，P<0.001，表2)。

2.4 Cox多因素回归分析将胃腺癌患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置、大体类型、分化程度、淋巴结转移、TNM分期、WWOX、ABCG2、吸烟以及饮酒等因素，经Cox多因素回归模型分析：WWOX和ABCG2蛋白的表达及TNM分期是影响胃腺癌患者术后生存时间的独立预后因素(表3)。

2.5 生存分析本组经Kaplan-Meier生存分析显示，WWOX蛋白阳性组与阴性组的中位生存时间分别为(66.2±16.4)个月和(36.7±18.9)个月，Log-rank分析两组总生存时间差异有统计学意义(P<0.001，图2A)；ABCG2蛋白阳性组与阴性组患者的中位生存时间分别为(67.4±15.0)个月和(36.8±18.9)个月。Log-rank分析两组总生存时间差异有统计学意义(P<0.001，图2B)。

表1 WWOX和ABCG2蛋白表达与胃腺癌临床病理特征的关系

表2 WWOX和ABCG2蛋白表达的相关性

表3 胃腺癌患者的多因素分析

图2 胃腺癌患者生存曲线: A.WWOX表达与胃腺癌患者预后的关系；B.ABCG2表达与胃腺癌患者预后的关系

3 讨论

尽管各种新的治疗手段(如靶向治疗、免疫治疗等)在一定程度改善胃腺癌患者的预后，但胃腺癌患者术后总生存时间并未显著延长。因此，需寻找能够预测胃腺癌患者浸润、转移和预后的标志物。抑癌基因的表达异常降低或缺失是肿瘤发生、发展中的关键环节。WWOX又叫脆性位点FRA16D氧化还原酶，是近年才发现的抑癌基因。WWOX基因定位于人染色体16q23.3-24.1，含有9个外显子和8个内含子，编码长度为414个氨基酸残基的蛋白质。众多的研究表明，WWOX基因可以抑制肿瘤细胞的增殖、浸润、转移以及促进凋亡[10-11]。WWOX在正常组织中广泛表达，其在多种肿瘤组织中主要表现为半盒子和纯合子缺失，导致其表达降低或缺失。本组采用免疫组化EnVision法检测WWOX蛋白在胃腺癌组及对照组中的表达，发现在胃腺癌组中WWOX蛋白的阳性率显著低于其在对照组中的阳性率，差异有统计学意义。进一步分析发现，随着胃腺癌分化越差，WWOX蛋白阳性率越低，差异有统计学意义；淋巴结转移组中WWOX蛋白的阳性率也显著低于无淋巴结转移组中的阳性率；TNM分期越高，WWOX蛋白的阳性率也越低，差异均有统计学意义。上述结果表明，WWOX蛋白表达的异常降低或缺失可能促进胃腺癌的增殖、浸润及转移，该结果与其他学者的研究结果一致[4-6,12]。

ABCG2是ABC转运蛋白家族重要成员之一，该家族成员属于跨膜蛋白，最先在乳腺癌细胞株MCF-7中发现，能够抵抗部分化疗药物的抗肿瘤作用，主要通过其位于细胞膜上的泵将细胞内的抗癌药物转运到细胞外。ABCG2能通过泵将肿瘤细胞内的药物主动转运到细胞外，从而促进肿瘤细胞多药耐药的形成[13]。众多研究表明，ABCG2表达异常增高，常常意味着肿瘤患者术后易于复发、转移，且预后较差[14]。2012年有学者发现ABCG2表达增强能够促进CSC中的SP细胞形成，随后在多种肿瘤组织中发现相似作用，因此认为ABCG2是一个新的CSC标志物。本实验发现ABCG2蛋白在胃腺癌阳性率显著高于其在对照组中的阳性率，差异有统计学意义。进一步分析发现，随着胃腺癌组织分化越差，ABCG2蛋白的阳性率越高，差异有统计学意义；淋巴结转移组中ABCG2蛋白的阳性率也显著高于无淋巴结转移组中的阳性率；TNM分期越高，ABCG2蛋白的阳性率也越高，差异均有统计学意义。上述结果表明，ABCG2蛋白表达的异常增高可能参与胃腺癌的发展、浸润及转移等过程，与其他学者的研究结果一致[7-10]。

目前，根据患者TNM分期制定治疗策略的原则已被广泛接受，但是由于肿瘤的异质性和演进，TNM分期难以完全反应每个肿瘤患者的具体生物学特性。因此，迫切需要找到能够预测每个肿瘤的生物学行为的标记。ABCG2蛋白阳性组患者术后总生存时间明显低于其阴性组；WWOX蛋白阳性组患者的术后总生存时间明显高于其阴性组，Log-rank分析表明差异均有统计学意义。多因素分析表明WWOX和ABCG2蛋白阳性以及TNM分期是影响胃腺癌患者术后生存的独立预后因素。Spearman相关分析显示WWOX和ABCG2蛋白的表达呈负相关，差异均有统计学意义。于小棠等[15]通过质粒转染增强WWOX的表达，发现WWOX能够抑制CSC的干性，包括自我更新能力、分化潜能、体内致瘤能力、干细胞基因的高水平表达和多药耐药性。Li等[16]通过基因沉默技术降低WWOX的表达，发现WWOX可能通过Hippo、MAPK以及TGF-β等信号通路调节CSC的干性。表达异常增高的ABCG2可能参与胃腺癌的发生，并进一步促进胃腺癌细胞的增殖、浸润和转移。与此同时，表达降低或缺失的WWOX蛋白丧失其抑制CSC的自我更新及诱导肿瘤细胞分化的能力[13,15]，进一步促进胃腺癌细胞的增殖、浸润和转移，且ABCG2高表达和WWOX的低表达提示患者预后差。

综上所述，异常表达的ABCG2蛋白参与胃腺癌发生，可能与表达降低的WWOX协同促进胃腺癌的增殖、浸润及转移等过程。因此，在胃腺癌患者肿瘤组织中早期联合检测ABCG2和WWOX蛋白的表达，可作为预测胃腺癌患者术后浸润、转移及预后的候选指标之一。