肝细胞癌中SETDB1的表达及临床意义

李 征，夏朝霞，史静怡，汪春年

肝细胞癌是原发性肝癌中最常见的病理类型，严重威胁人类生命健康。据统计，我国肝细胞癌新发及死亡病例占全球半数以上[1]。近年虽然针对原发性肝癌的诊治取得一定进展，但其术后复发、转移仍然是影响肝癌患者预后不良的重要因素，肝癌患者5年生存率仅有5%[2]。因此探索肝细胞癌发生、发展的分子机制，寻找新的治疗靶点成为当下研究热点。组蛋白H3K9甲基化转移酶SETDB1属于组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶SET家族中的一员，位于1号染色体上，参与组蛋白H3K9me3的甲基化[3-4]。研究表明，SETDB1在结肠癌、白血病等多种肿瘤中高表达，对肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭具有促进作用[5-6]。本文采用qRT-PCR法检测SETDB1 mRNA在原发性肝细胞癌组织中的表达，旨在探讨其在肝细胞癌中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本收集2016～2018年浙江省宁波市临床病理诊断中心经病理确诊的原发性肝细胞癌64例，均为手术切除标本。通过调阅档案HE切片，每例挑选癌细胞含量>70%的蜡块1个及配对癌旁(距病灶>1 cm以上)正常肝组织蜡块1个，尽量避开出血、坏死区。64例肝细胞癌中，男性57例，女性7例。年龄40～80岁，平均59.1岁，中位年龄58.5岁。单个瘤体者55例，2个及以上瘤体者9例。肿瘤直径1～18 cm不等，多个瘤体者取直径总和，>5 cm者16例，≤5 cm者48例。低分化23例，中+高分化41例。伴肝硬化者37例，不伴肝硬化者27例。伴微血管侵犯(microvascular invasion, MVI)(M1或M2)者42例，不伴MVI者22例。pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期45例，Ⅲ+Ⅳ期19例。

1.2 主要试剂及仪器Luna Universal Probe One-Step qRT-PCR Kit(NEW ENGLAND BioLabs)；FFPE RNA提取试剂盒(OMEGA bio-tek)；qRT-PCR仪(美国ABI 7500)。SETDB1引物由Primer 5.0软件设计，上海生工生物公司合成；SETDB1上游引物：5′-CTATATGACTTCCGGCGGATGA-3′，下游引物：5′-GCATTGTCCGAAGGCAGAGA-3′；内参GAPDH引物购自上海生工生物公司。

1.3 qRT-PCR检测64对肝癌及癌旁正常组织蜡块，每个样本切5 μm厚4张，置于EP管中，按照试剂盒说明书步骤提取总RNA，并检测浓度及纯度，总RNA纯度A260/A280在1.8～2.1之间为合格。每个样本取1 μg RNA样品进行qRT-PCR反应，体系为20 μL，反应条件：55 ℃、10 min逆转录；95 ℃、1 min预变性；95 ℃、10 s，60 ℃、1 min，合计40个循环。每个样本重复3孔。采用2-ΔΔCt法计算SETDB1的相对表达量。

2 结果

2.1 SETDB1 mRNA在肝细胞癌及癌旁正常组织中的表达量qRT-PCR检测结果显示，41例(64.06%)肝细胞癌组织中SETDB1 mRNA表达量高于癌旁正常组织。肝细胞癌与癌旁正常组织中SETDB1相对表达量分别为(1.658±1.287)、(1.233±1.070)，差异有统计学意义(t=2.917，P=0.005，图1)。

图1 SETDB1 mRNA在肝细胞癌及癌旁正常组织中的表达

2.2 SETDB1 mRNA表达与肝细胞癌临床病理特征的关系肝细胞癌组织中SETDB1 mRNA表达水平与肿瘤大小、MVI分型及pTNM分期有关；与患者性别、年龄、瘤体个数、肿瘤分化程度及是否伴有肝硬化无关。肿瘤直径>5 cm者、伴有MVI(M1或M2)者及pTNM分期Ⅲ+Ⅳ者更易出现SETDB1表达上调(P<0.05，表1)。

3 讨论

肝癌表观遗传变异在肿瘤的发生、发展和复发转移中发挥重要作用[7]。研究报道SETDB1通过多种途径介导基因的沉默而激发肿瘤的发生，促进肿瘤的生长与增殖[8-9]。最近有研究发现，SETDB1在肝癌中的表达明显升高，与肝癌的进展、侵袭及预后有关。Wong等[10]应用转录子测序技术对HBV相关的肝细胞癌中591个表观遗传调节子进行检测，发现SETDB1是肝细胞癌中上调最显著的表观遗传调节子，其上调机制可能涉及多个阶段：染色体1q21上SETDB1基因拷贝数增加，可调控多个下游靶基因；转录水平SP1转录因子可促进SETDB1活性；转录后水平miR-29与SETDB1呈负相关。体内外实验表明，沉默SETDB1能抑制肝细胞癌增殖、迁移和侵袭能力。临床病理分析表明SETDB1上调与肝细胞癌疾病进展、癌侵袭性强及预后差相关。Fei等[11]研究发现SETDB1能通过p53甲基化调节肝细胞生长。Shao等[12]研究发现SETDB1是miR-621的直接靶基因，miR-621通过抑制SETDB1，激活p53途径，最终增强肝细胞癌的放射敏感性。Zhang等[13]研究显示SETDB1与Tiam1作用，促进细胞增殖和迁移。陈静等[14]通过敲除SETDB1研究其对肝癌细胞体内外增殖凋亡能力的影响，结果显示下调SETDB1能通过H3在K9位点的甲基化发挥抗肿瘤生长作用。

表1 肝细胞癌中SETDB1 mRNA的表达与临床病理特征的关系[n(%)]

本实验采用qRT-PCR技术，对64例原发性肝细胞癌中癌组织和癌旁正常组织中SETDB1 mRNA表达进行检测，结果与上述文献报道一致，进一步证实SETDB1在肝细胞癌组织中高表达。临床病理相关性分析表明，肿瘤直径>5 cm者、伴有MVI(M1或M2)者及pTNM分期Ⅲ+Ⅳ者更易出现SETDB1 表达上调。陈静等[14]发现肝细胞癌中SETDB1蛋白高表达与肿瘤大小有关，与本组结果相似；虽然他们并未发现SETDB1蛋白表达与pTNM分期有相关性，但结果显示Ⅲ+Ⅳ期者SETDB1蛋白阳性率高于Ⅰ+Ⅱ期者，与本组结果相符。有研究发现，伴有MVI患者往往肿瘤体积更大，且生存期较短[15]。因此，本组发现SETDB1表达与MVI及肿瘤大小有相关性，提示SETDB1表达上调可能与肝细胞癌患者预后差相关，检测肝细胞癌中SETDB1表达水平对评估临床肿瘤进展和患者预后有一定价值。

综上所述，SETDB1在原发性肝细胞癌中表达上调，且表达上调与肿瘤大小、MVI及pTNM分期密切相关，提示SETDB1是肝细胞癌侵袭和预后不良的生物学指标。对于SETDB1表达与肝细胞癌其他临床病理特征及预后的关系还需扩大样本量，并结合SETDB1蛋白表达进一步分析。虽然已有文献报道SETDB1与肝细胞癌疾病进展、侵袭性及预后密切相关，但其在肝细胞癌复发转移中的作用机制仍需进一步分析。随着研究的逐渐深入，SETDB1有望成为肝细胞癌的治疗靶点。