涎腺腺样囊性癌中CXCR1、N-cadherin、Ki-67和vimentin的表达及其与淋巴结转移、神经侵袭的关系

杜洪亮，车银富，于 涛，陶 峰，何等旗

涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是发生于涎腺常见的恶性肿瘤，占涎腺恶性肿瘤的7.5%～10%[1]，具有沿神经侵袭性进展，易远处转移、复发的特性，神经侵袭是其重要的生物学特性[2-3]。近年多种细胞蛋白的表达被认为与肿瘤相关，包括CXCR1、VEGF、N-cadherin、YAP、vimentin、MYB、Survivin等[4-7]。CXCR1是趋化因子CXCR家族的重要成员，研究显示其异常表达与肿瘤的侵袭和转移有关[8]。N-cadherin介导细胞与细胞之间的黏附，其表达增加可促进肿瘤的侵袭和转移[9]。Ki-67是细胞增殖活性的标志物[10]，vimentin稳定表达于间叶细胞，其异常表达与细胞发生间叶表型转变有关[11]。目前，CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin在SACC中的表达及其与淋巴结转移、神经侵袭的关系尚不清楚。本文通过检测CXCR1、N-cadherin、Ki-67和vimentin蛋白在SACC中的表达，分析其与临床病理特征、淋巴结转移和神经侵袭的关系，为SACC相关机制分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集兰州大学第一医院口腔颌面外科2013年1月～2018年12月病理确诊的SACC蜡块标本39例。纳入标准：(1)发生于大涎腺或小涎腺；(2)临床病理资料完整；(3)术前均未接受放、化疗，并均在我院接受手术治疗；(4)蜡块标本合格。SACC中男性19例，女性20例，年龄21～87岁，平均50岁。肿瘤位于大涎腺26例(腮腺14例、舌下腺9例、颌下腺3例)，位于小涎腺13例(上腭10例，颊腺2例，颞下窝1例)。另选取10例癌旁正常涎腺组织作为对照。本实验获兰州大学第一医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 方法免疫组化采用SP法染色，试剂购自北京中杉金桥公司。兔抗人CXCR1、N-cadherin多克隆抗体，购自Santa Cruz公司；鼠抗人Ki-67单克隆抗体，购自北京中杉金桥公司；鼠抗人vimentin单克隆抗体(检测包含肿瘤细胞及肿瘤间质)，购自Bio Genex公司；具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3 结果判断免疫组化染色评估由两名病理科医师采用双盲法进行。首先进行定性分析抗体染色表达模式的差异，然后进行定量分析。两名病理医师判断的差异通过讨论解决，有争议标本请第三名病理科医师阅片。CXCR1阳性为胞质或胞核中呈棕黄色颗粒。N-cadherin阳性为细胞膜和(或)细胞质中呈棕黄色。Ki-67阳性为细胞核内呈棕黄色颗粒。vimentin阳性主要定位于胞质，靠近胞膜，呈棕黄色颗粒。每个标本随机取5个100倍视野，按细胞着色强度计分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞百分数计分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分， 51%～75%为3分，>75%为4分；两项得分结果相加< 2分为(-)，2～3分为(+)，4～5分为()，6～7分为()，本实验将0～3分定义为阴性，4～7定义为阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。CXCR1、E-cadherin、Ki-67、vimentin在SACC与癌旁正常组织之间表达的差异采用χ2检验，CXCR1、E-cadherin、Ki-67、vimentin的表达与临床病理特征的关系及其与淋巴结转移、神经侵袭的关系采用Fisher确切概率法分析，检验水准为α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin在SACC和癌旁正常组织中的表达CXCR1在癌旁正常组织中极少表达，在SACC组织细胞中大量表达，且阳性染色主要定位于细胞质，细胞核中较少表达。N-cadherin阳性染色主要定位于细胞膜。Ki-67阳性染色主要定位于细胞核。vimentin阳性染色定位于细胞质。SACC中CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的阳性率分别为66.67%、74.36%、56.41%、71.79%，与癌旁正常组织相比，差异有统计学意义(P<0. 05，表1，图1～4)。

图1 A.CXCR1在癌旁正常组织中的表达，SP法；B.CXCR1在SACC组织中的表达，SP法 图2 A.N-cadherin在癌旁正常组织中的表达，SP法；B.N-cadherin在SACC组织中的表达，SP法 图3 A.Ki-67在癌旁正常组织中的表达，SP法；B.Ki-67在SACC组织中的表达，SP法

图4 A.vimentin在癌旁正常组织中的表达，SP法；B.vimentin在SACC组织中的表达，SP法

表1 SACC和癌旁正常组织中CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的表达[n(%)]

组间比较，*P<0.05

2.2 CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的表达与SACC临床病理特征的关系CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin表达与患者年龄、性别、发生部位、浸润深度，差异无统计学意义(P>0.05)。CXCR1、N-cadherin、Ki-67表达与肿瘤大小，差异无统计学意义(P>0.05)，vimentin表达与肿瘤直径≥3 cm和<3 cm，差异有统计学意义(P=0.011)。Ki-67在低分化组与中+高分化组的表达，差异无统计学意义(P>0.05)。CXCR1、N-cadherin和vimentin在低分化组和中+高分化组的表达，差异有统计学意义(P=0.017，P=0.002，P=0.011，表2)。

2.3 CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的表达与淋巴结转移、神经侵袭的关系CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin表达与有无淋巴结转移，差异无统计学意义(P>0.05)。CXCR1和vimentin表达与有无神经侵袭，差异无统计学意义(P>0.05)。N-cadherin和Ki-67表达与有无神经侵袭，差异有统计学意义(P=0.017，表3)。

3 讨论

SACC是具有神经侵袭和远处转移特性的涎腺恶性肿瘤[12]。多种趋化因子和蛋白的表达与SACC的神经侵袭和远处转移相关[13-15]。CXCR1是CXC趋化因子受体家族的重要成员，主要表达于中性粒细胞、淋巴单核细胞等各种炎症细胞表面，大量研究发现，CXCR1与多种肿瘤的发生、增殖、生长、侵袭转移等发挥重要作用[16-17]。亦有研究显示，CXCL12/CXCR4可能与SACC嗜神经侵袭有关[18]。本组CXCR1在SACC组织细胞中大量表达，且阳性染色主要定位于细胞质，且CXCR1在SACC的表达比癌旁正常涎腺组织明显增高；提示CXCR1的表达与SACC相关，同时发现CXCR1在低分化组的表达明显高于中+高分化组，与Xue等[19]的研究一致，但未发现CXCR1的表达与患者年龄、性别、发生部位、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移、神经侵袭，差异有无统计学意义。

表2 SACC中CXCR1、E-cadherin、Ki-67、vimentin表达与临床病理特征的关系

a为Fisher精确概率检验

表3 淋巴结转移、神经侵袭与CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin表达的关系

a为Fisher精确概率检验

钙黏蛋白转化是上皮细胞-间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)的重要机制之一，表现为E-cadherin向N-cadherin转化[20]。研究显示，N-cadherin表达的增高与多种恶性肿瘤的侵袭转移过程密切相关[21]。本组N-cadherin的表达在SACC组织中明显升高。同时发现N-cadherin在低分化组的表达高于中+高分化组，且存在神经侵袭SACC中N-cadherin的表达明显增高，与Yi等[22]的研究一致， N-cadherin在胆囊癌低分化组的表达高于中+高分化组，且存在侵袭组N-cadherin的表达明显增高；提示N-cadherin高表达与SACC的神经侵袭和分化程度有关。

Ki-67是细胞增殖相关的核蛋白，其与肿瘤增殖、侵袭、预后密切相关[10]。本组Ki-67在SACC中的表达高于癌旁正常组织，且在有神经侵袭的SACC中的表达明显增高；提示Ki-67与SACC的神经侵袭可能有关。Ki-67表达增多说明细胞增殖活跃，提示肿瘤细胞增殖与神经侵袭可能相关。目前，Ki-67表达与神经侵袭之间的关系，国内外研究尚未见报道。

研究显示，EMT是肿瘤发生、发展的重要因素。vimentin作为EMT过程中的重要因子，参与肿瘤的侵袭和转移等复杂过程[23]。本组vimentin在SACC中的表达明显增高，且其高表达与肿瘤大小、肿瘤分化程度相关。有研究表明，vimentin可以控制细胞增殖，如一些促进细胞增殖的因素：血小板衍生生长因子、胰岛素和表皮生长因子可以增加小鼠3T3细胞中vimentin mRNA的水平[24]。vimentin的丢失可以减少成纤维细胞的增殖，降低EMT的主要起始物TGF-β1的水平[25]。

综上所述，CXCR1、N-cadherin、Ki-67、vimentin的表达与SACC发生、发展相关。N-cadherin和Ki-67与SACC的神经侵袭相关。CXCR1、N-cadherin和vimentin与SACC的细胞分化程度相关。目前，其具体机制尚不清楚，需更深入的分析CXCR1、N-cadherin、Ki-67和vimentin与SACC临床病理特征的关系。