MDA-MB-231细胞在乏氧条件下通过外泌体传递miR-221、miR-222增强乳腺癌细胞侵袭和迁移能力

秦爱伟，于梦雨，盖程程，李文通，吕世军

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，且发病率和病死率均逐年增高，肿瘤转移是导致癌症死亡的主要原因[1]。肿瘤由于细胞快速分裂和异常血管形成而出现严重乏氧，肿瘤乏氧通常与患者预后不良有关[2]。miR-221和miR-222是X染色体上2个高度同源的miRNA，有研究表明，miR-221、miR-222在ER阴性乳腺癌细胞系明显上调[3-4]。外泌体是一种细胞分泌的直径40～100 nm的微小囊泡，囊泡中含有的核酸可作为信号分子传递给其他细胞，该过程在肿瘤的生长和转移中起重要作用[5-6]。乏氧细胞可能通过外泌体将miR-221、miR-222传递给其他细胞，进而增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。本文对MDA-MB-231细胞进行乏氧处理，检测其侵袭和迁移，着重探讨乳腺癌细胞MDA-MB-231在乏氧条件下分泌的外泌体对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料细胞：人三阴型乳腺癌细胞系MDA-MB-231，购自上海细胞生物研究所。试剂：RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；一抗：β-actin、CD81、TSG101、E-cadherin、N-cadherin和vimentin购自Abcam公司；二抗：鼠、兔二抗购自Abcam公司；Pierce ECL化学发光液购自美国Thermo公司；PKH26购自上海懋康生物公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自碧云天生物研究所；BCA试剂盒和MTT购自美国Sigma公司；miR-221、miR-222抑制剂(分别为221i和222i)和Lipofectamine 2000，均购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1MDA-MB-231细胞乏氧处理 正常对照组在37 ℃、5%CO2的湿化培养箱中培养。MDA-MB-231细胞置于低氧培养箱中，使细胞暴露于持续低氧(0.1% O2)条件下，其他条件与对照组细胞相同。

1.2.2外泌体的提取及鉴定 提取外泌体前，用无血清培养基培养细胞48 h。采用差速离心法分离外泌体，分别以300g×10 min、1 000g×20 min、10 000g×30 min的速度从上清液中去除细胞碎片和大泡。然后以100 000g的速度离心1 h，纯化并收集外泌体。用透射电镜和动态光散射对外泌体进行表征。用RIPA裂解缓冲液裂解外泌体，Western blot法检测提取的外泌体中TSG101和CD81蛋白的表达。

1.2.3外泌体摄取 为了观察MDA-MB-231细胞对外泌体的摄取情况，MDA-MB-231细胞种于6孔板(2×105个/孔)中，采用亲脂荧光染料PKH26对外泌体进行染色，然后透析去除游离染料，加入孔中，孵育4 h后，PBS洗涤细胞3次，用荧光显微镜观察。

1.2.4敲除miR-221、miR-222 采用添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中。采用Lipofectamine 2000转染细胞，每孔使用等量的anti-miR-221、anti-miR-222或anti-miR对照。6 h后，培养基改为添加2%胎牛血清的RPMI 1640。转染后24 h或48 h收集细胞，用于后续分析。

1.2.5细胞划痕实验 将MDA-MB-231细胞接种于6孔板培养液中，培养至80%。用200 μL无菌枪头在孔中央创建划痕，然后用PBS冲洗脱落细胞。在实验组中加入乏氧处理细胞的外泌体，然后在0 h和48 h评估细胞迁移情况。

1.2.6Transwell侵袭实验 将对照组和实验组细胞进行胰酶消化和细胞计数，上腔室涂Matrigel基质胶，将300 μL MDA-MB-231细胞悬液(1×105个/孔)接种于上室，下室加入500 μL含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃培养24 h，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色。然后对侵入下层的细胞进行计数。

1.2.7qRT-PCR 使用Trizol试剂按照试剂盒说明书从细胞中提取总RNA，采用7500 RT-PCR系统，对MDA-MB-231细胞miR-221、miR-222的表达进行检测。GAPDH作为miR-221、miR-222的内源性对照，PCR引物序列如下。GAPDH(正义链)：5′-TTGTCAAGCTCGTTTCTTGGT-3′；GAPDH(反义链)：5′-CCTAGTCTCCATGGTCTCACT-3′。 miR-221(正义链)：5′-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATTGTCTGCT GG-3′；miR-221(反义链)：5′-CTCAACTGGTGTCGTG GA-3′。 miR-222(正义链)：5′-ACACTCCAGCTGGG AGCTACATCTGGCTACTG-3′； miR-222(反义链)：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。

1.2.8Western blot法 将细胞裂解后，采用BCA法检测蛋白浓度，并将其浓度调至相同水平。用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解产物，并将凝胶印迹转移PVDF膜上。将膜置于5%脱脂奶粉中封闭；分别与E-cadherin、N-cadherin和vimentin的一抗(1 ∶1 000)杂交，4 ℃过夜孵育。置于二抗中室温孵育2 h，ECL显色，以β-actin(1 ∶4 000)为内参对条带进行灰度值分析。

2 结果

2.1 外泌体鉴定和细胞摄取动态光散射分析显示外泌体的平均直径为(80.69±18.11) nm(PDI为0.419)，透射电镜结果显示外泌体形态为具有膜结构的囊泡，与动态光散射测定的外泌体大小相似(图1A)。Western blot结果显示，外泌体中不含β-actin，说明外泌体没有被细胞器污染；与细胞裂解液相比，外泌体中TSG101和CD81特异标志物更丰富，证实分离的颗粒为外泌体(图1B)。

本实验将PKH26标记的外泌体加入MDA-MB-231细胞中，4 h后结果显示被标记的外泌体(红色荧光颗粒)已被细胞摄取(图1C)。

图1 外泌体鉴定和细胞摄取：A.动态光散射检测的外泌体大小和分布及透射电镜下外泌体的形态；B.Western blot测定外泌体中TSG101和CD81蛋白表达；C.MDA-MB-231细胞对PKH26标记外泌体的摄取情况

2.2 乏氧处理增强MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力MDA-MB-231细胞通过乏氧处理后，其迁移能力(图2)和侵袭(图3)有所增强。

2.3 乏氧细胞分泌的外泌体加速肿瘤细胞EMTWestern bolt结果显示乏氧肿瘤细胞来源的外泌体，显著上调MDA-MB-231细胞中N-cadherin和vimentin的表达，同时我们量化了EMT相关生物学标志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin水平的变化(图4)。

2.4 乏氧细胞释放外泌体转运miR-221、miR-222促进肿瘤细胞EMT采用qRT-PCR验证miR-221、miR-222在乏氧肿瘤细胞和正常肿瘤细胞之间的差异表达，乏氧细胞中的miR-221、miR-222相对于正常肿瘤细胞有所增加；应用miR-221和miR-222反义抑制剂的Lipofectamine 2000敲除内源性miR-221和miR-222，结果显示：降低乏氧肿瘤细胞内miR-221、miR-222的表达(图5)。敲除miR-221、miR-222的乏氧细胞迁移和侵袭能力有所减弱，而加入敲除miR-221、miR-222的乏氧细胞外泌体后，MDA-MB-231细胞的迁移(图6)和侵袭(图7)能力并无明显改变。

图2 细胞划痕实验检测MDA-MB-231细胞经乏氧处理后的迁移能力：A.常氧组(0 h)；B. 乏氧组(0 h)；C.常氧组(48 h)；D. 乏氧组(48 h)

图3 Transwell侵袭实验检测MDA-MB-231细胞经乏氧处理后的侵袭能力：A.常氧组，B.乏氧组

图4 Western blot法加入乏氧肿瘤细胞分泌的外泌体后MDA-MB-231细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和vimentin)的表达：A.电泳图；B.柱状图

图5 miR-221、miR-222在不同处理后的表达

3 讨论

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，三阴型乳腺癌是一种特殊类型的乳腺癌，其特征是ER、PR以及HER-2表达均缺失。与ER、PR和HER-2均阳性乳腺癌相比，三阴型乳腺癌预后较差[7]。肿瘤的预后差可能是由于肿瘤细胞在乏氧状态下，更易发生抗肿瘤免疫[8]，并且肿瘤转移前可在某些特定器官和组织构建转移前肿瘤微环境，外泌体通过传递信息影响靶细胞的功能，参与上述过程的调控[9]。外泌体是一种能够被大部分细胞所分泌的微小囊泡，可将细胞内的物质传递出去；除传递miRNA外，还可以递送多种物质，如蛋白质、脂类、DNA、mRNA等，并通过信息传递，在癌细胞与微环境之间发挥作用[10-11]。

图6 MDA-MB-231细胞迁移：A.加入空白Lipofectamine 2000(0 h)；B.加入miR-221、miR-222抑制剂(0 h)；C.加入空白Lipofectamine 2000(48 h)；D.加入miR-221、miR-222抑制剂(48 h)；E.空白对照组(0 h)；F.加入敲除miR-221和miR-222的肿瘤细胞外泌体(0 h)；G.空白对照组(48 h); H.加入敲除miR-221和miR-222的肿瘤细胞外泌体(48 h) 图7 MDA-MB-231细胞的侵袭：A.加入空白Lipofectamine 2000；B.加入miR-221、miR-222抑制剂；C.空白对照组；D.加入敲除miR-221和miR-222后的肿瘤细胞外泌体

本实验检测MDA-MB-231细胞在乏氧条件下产生的外泌体对肿瘤细胞EMT的影响。结果表明，乏氧促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。同时，本组发现在乏氧条件下MDA-MB-231细胞产生的外泌体也促进肿瘤细胞的EMT进展。miR-221和miR-222是X染色体上2个高度同源的miRNA，它们具有相同的种子序列，并充当1个基因簇(miR-221、miR-222)[12]。miR-221、miR-222的过表达发生于大多数上皮性肿瘤中[13]。miR-221、miR-222在ER阴性乳腺癌细胞系和原发肿瘤组织中表达上调[14]。本实验分析miR-221、miR-222对乳腺癌细胞的作用机制，其中PTEN作为抑癌基因已被确定为miR-221、miR-222的直接靶点[15-16]。本实验对MDA-MB-231细胞进行乏氧培养，发现其迁移和侵袭能力明显增强，随后检测细胞中miR-221、miR-222表达水平，发现乏氧培养的MDA-MB-231细胞中miR-221、miR-222水平显著上调。我们将乏氧MDA-MB-231细胞中的miR-221、miR-222沉默，发现细胞的迁移和侵袭明显减弱，提示miR-221、miR-222对乏氧肿瘤细胞的迁移和侵袭有促进作用。将乏氧MDA-MB-231细胞分泌的外泌体加入未做乏氧处理的肿瘤细胞共培养，发现肿瘤细胞的迁移和侵袭明显增强，提示外泌体所携带的miR-221、miR-222能够提高肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

本实验结果表明乏氧培养MDA-MB-231细胞分泌的外泌体可通过转运miR-221、miR-222促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，miR-221、miR-222促进三阴型乳腺癌细胞的存活、迁移和侵袭，有望成为三阴型乳腺癌新的治疗靶点。