非小细胞肺癌中YAP1、SRPX2的表达与微血管密度及预后的相关性分析

王婷婷，李忠华，李慧峰，杨文秀，李晓蕾

肺癌是常见的恶性肿瘤，5年相对存活率为18%[1]，约85%的肺癌是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[2]。多数患者在确诊时被发现已发生远处转移，预后差[3]，导致肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的关键因素是血管生成。YAP1是HIPPO通路的核心效应因子，高表达的YAP1参与肿瘤的增殖、复发、迁移等恶性行为，最近研究显示其还参与肿瘤的血管生成过程[4]。SRPX2参与肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭等生物学过程，并对血管生成具有积极的促进作用[5]。Marti等[6]研究显示SRPX2是YAP1依赖的基因，YAP1可能通过SRPX2发挥作用，但两者在NSCLC中表达的相关性未见报道。本文着重探讨YAP1和SRPX2在NSCLC组织中表达的相关性及两者表达与微血管密度(microvessel density, MVD)的关系，为NSCLC的病理诊断和临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料选取贵州医科大学附属第三医院2010～2019年存档的穿刺活检或手术切除诊断为NSCLC的石蜡标本80例。纳入标准：(1)所有病例经病理诊断为NSCLC；(2)初次治疗，临床和病理资料保存完整；(3)无其他类型的肿瘤；(4)术前未接受过放、化疗。本组患者男性47例，女性33例。年龄37～83岁，其中<60岁者40例，≥60岁者40例。病理分型：鳞癌36例，腺癌44例。TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ+Ⅳ期52例；淋巴结转移者41例，无淋巴结转移者39例；选取28例癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm)作为对照。所有标本的使用均经患者知情同意，本实验经贵州医科大学第三附属医院伦理委员会批准。

1.2 试剂兔抗人YAP1、SRPX2、CD34多克隆抗体购自英国Abcam公司。RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒、Western blot试剂盒购自上海碧云天公司。ECL发光试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒，均购自北京中杉金桥公司。

1.3 Western blot法提取肺鳞癌、肺腺癌及其癌旁正常组织中的蛋白，测定组织蛋白浓度，沸水浴使蛋白变性。配置分离胶和浓缩胶后置于电泳槽固定，加入电泳液后上样待测蛋白开始电泳。湿化转膜，切取适当大小的PVDF膜，在装有转膜液的方盘内依次放置转膜夹、海绵夹、滤纸、胶、PVDF膜，赶走气泡后合拢转膜夹，置于转膜槽中冰浴转膜2 h。转膜结束后取出膜，根据蛋白分子量剪膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。封闭液稀释一抗YAP1和SRPX2，4 ℃过夜。TBST洗涤3次后，加入二抗，孵育2 h。ECL避光显色，自动电泳凝胶成像分析仪采集结果。

1.4 免疫组化NSCLC组织及其癌旁正常组织进行常规石蜡切片，厚4 μm。65 ℃烤2.5 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，待微波炉内pH 6.5的枸橼酸钠缓冲液沸腾后，放入切片转入低温进行抗原修复10 min，室温下复温。滴入3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，山羊血清封闭非特异性位点，分别加入YAP1、SRPX2和CD34(购自英国Abcam公司，稀释比为1 ∶100)，4 ℃过夜。PBS溶液代替一抗作为阴性对照。室温复温、洗涤后加入二抗、辣根酶标记链霉卵白素，DAB溶液显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.5 结果判定光镜下随机选取5个高倍镜视野观察切片，YAP1阳性定位于细胞质、细胞核内，呈棕黄色颗粒；SRPX2阳性定位于细胞质内，呈棕黄色颗粒。根据阳性细胞百分数计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。根据细胞染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。上述两项得分结果相乘：0～2分为阴性，3～12分为阳性。切片均由两位病理科医师采用双盲法独立阅片。

1.6 MVD计数采用Weidner法，用CD34标记肿瘤微血管，于低倍镜下在肿瘤间质内寻找微血管密集的区域，然后用高倍镜计数5个视野的微血管数，取其平均值为MVD值。任何可被染成棕黄色呈阳性的血管内皮细胞或内皮细胞簇，与邻近血管、肿瘤细胞或其他组织之间存在明显分隔的视为1个微血管。

1.7 随访对确诊患者采用复诊或电话方式进行随访，截止日期为2019年3月，随访3～107个月。

2 结果

2.1 Western blot法检测YAP1和SRPX2在NSCLC及癌旁正常组织中的表达Western blot法检测20例NSCLC组织(肺鳞癌10例、肺腺癌10例)与癌旁正常组织中YAP1和SRPX2蛋白的表达，结果显示：YAP1和SRPX2在肺鳞癌和肺腺癌组织中的表达均明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(图1)。

图1 Western blot法检测YAP1、SRPX2蛋白在NSCLC及癌旁正常组织中的表达：A.YAP1和SRPX2蛋白的表达：1.癌旁组织，2.肺鳞癌组织，3.肺腺癌组织； B.YAP1蛋白相对表达量；C.SRPX2蛋白相对表达量

2.2 免疫组化法检测YAP1和SRPX2在NSCLC及癌旁正常组织中的表达YAP1阳性染色主要表达于细胞核，少数表达于细胞质。SRPX2阳性染色表达于细胞质。YAP1和SRPX2在NSCLC组织中的阳性率分别为62.5%(50/80)和55%(44/80)；YAP1和SRPX2在癌旁正常组织中的阳性率分别为7.14%(2/28)和0。YAP1和SRPX2在NSCLC组织中的阳性率均高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05，图2、3)。

图2 A.YAP1在癌旁正常组织中呈阴性，SP法；B.YAP1在肺鳞癌组织中呈阳性，SP法；C.YAP1在肺腺癌组织中呈阳性，SP法

图3 A.SRPX2在癌旁组织中呈阴性，SP法；B.SRPX2在肺鳞癌组织中呈阳性，SP法；C.SRPX2在肺腺癌组织中呈阳性，SP法

2.3 YAP1、SRPX2及MVD与NSCLC临床病理特征的关系YAP1和SRPX2的表达与NSCLC患者性别、年龄、吸烟、病理类型、分化程度均无相关性，差异无统计学意义(P>0.05)；与TNM分期、淋巴结转移相关，差异有统计学意义(P<0.05)。MVD表达与NSCLC患者年龄、吸烟、病理类型无相关性，差异无统计学意义(P>0.05)；与分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 YAP1、SRPX2表达及MVD与 NSCLC临床病理特征的关系

图4 YAP1和SRPX2在NSCLC组织中共表达:YAP1(A)和SR-PX2(B)在同一例肺腺癌组织中呈阳性,SP法;YAP1(C)和SRPX2(D)在同一例肺鳞癌组织中呈阳性,SP法 图5 CD34在NSCLC组织中的表达:A.CD34在NSCLC组织中呈阴性,SP法;B.CD34在NSCLC中呈阳性,SP法

2.4 YAP1、SRPX2和MVD在NSCLC中表达的相关性在80例NSCLC组织中YAP1阳性50例，SRPX2阳性44例，YAP1阴性30例，SRPX2阴性36例。两者均阳性38例，均阴性24例。Spearman相关分析结果显示，YAP1与SRPX2在NSCLC组织中的表达水平呈正相关(r=0.545，P<0.05，表2，图4)。

表2 NSCLC中YAP1与SRPX2表达的相关性

YAP1表达与MVD值均存在正相关(r=0.580)，差异有统计学意义(P<0.05)。SRPX2表达与MVD值呈正相关(r=0.475，P<0.05)。YAP1和SRPX2阳性组MVD值分别高于YAP1和SRPX2阴性组，且YAP1和SRPX2共同阳性组MVD值高于YAP1和SRPX2共同阴性组，差异均有统计学意义(P<0.05，表3，图5)。

2.5 YAP1、SRPX2表达与NSCLC患者预后的关系应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，YAP1阴性组生存期明显高于阳性组，Log-rank检验显示，两组间差异有统计学意义(χ2=4.371，P=0.037)。SRPX2阴性组生存期明显高于阳性组，Log-rank检验显示，两组间差异有统计学意义(χ2=5.589，P=0.018)。YAP1和SRPX2共阴性组生存期最高，两者共阳性组生存期最短，Log-rank检验显示，差异有统计学意义(χ2=6.433，P=0.040，图6)。

表3 NSCLC中YAP1和SRPX2表达与MVD值的关系

3 讨论

HIPPO信号通路是由一系列不同的蛋白质组成，具有控制器官大小、组织再生等功能[7]，与肿瘤的发生、发展密切相关。YAP1是衔接HIPPO通路和其下游分子的核心因子，在多种恶性肿瘤组织中均为高表达，具有促癌功能[8-9]。本组通过Western blot法和免疫组化法检测亦显示，YAP1在NSCLC组织中高表达，阳性率为62.5%，YAP1表达与TNM分期、淋巴结转移及预后明显相关，与Hsu等[10]的研究结果一致，提示YAP1可能在NSCLC增殖、侵袭和转移过程中发挥重要作用。

图6 Kaplan-Meier生存曲线分析：A.YAP1表达与NSCLC患者预后的关系；B.SRPX2表达与NSCLC患者预后的关系；C.YAP1和SRPX2不同表达与NSCLC患者预后的关系

YAP激活MAPK或PI3K-AKT信号通路影响肿瘤细胞的生长[11-12]。SRPX2是属于新型的硫酸软骨素蛋白聚糖，在肿瘤的研究中发现SRPX2可能是MAPK和PI3K-AKT信号的下游基因[13-14]。SRPX2蛋白与SELP、SELP和SVEP-1同属于选择素基因家族，可促进肿瘤细胞和内皮细胞之间的相互作用，导致肿瘤的进展、转移和促进血管生成[15]。本组Western blot法和免疫组化法检测均显示，SRPX2在NSCLC组织中高表达。SRPX2阳性率为55%，与TNM分期、淋巴结转移和预后明显相关。Spearman相关分析结果显示，NSCLC组织中YAP1与SRPX2表达水平呈正相关(r=0.545,P<0.05)。YAP1和SRPX2共阴性组生存期明显高于两者共阳性组(P=0.043)。以上结果提示YAP1和SRPX2共同表达与NSCLC的侵袭、转移、预后关系密切。

MVD是标记肿瘤血管内皮细胞，对肿瘤微血管进行观察和量化的常用指标。本组采用免疫组化法检测CD34在NSCLC组织中的表达计数MVD值，发现MVD的表达与NSCLC分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关，证实肿瘤的恶性程度越高，MVD值越高。YAP1可以促进内皮细胞增殖、血管生成以及诱导血管发育不全[16]。SRPX2作为尿激酶纤溶酶原激活物表面受体的配体，诱导内皮细胞迁移和血管网络的形成。本组实验分析显示，YAP1和SRPX2阳性组MVD值分别高于YAP1和SRPX2阴性组;Spearman相关分析结果显示，YAP1和SRPX2表达与MVD值均存在正相关；提示YAP1和SRPX2可能影响NSCLC的血管生成。

综上所述，本组实验发现YAP1和SRPX2在NSCLC中相互作用，两者可能共同参与NSCLC的血管生成。因此，深入分析YAP1和SRPX2表达的调控机制，可能为NSCLC的诊断和靶向治疗提供新的线索和思路。