四君子汤对脾气虚证模型大鼠股四头肌线粒体自噬和细胞凋亡水平的影响＊

段志园，许欣竹，谢 鑫，刘文俊，陈 靖，柴纪严，吴成举，单德红＊＊

（1. 辽宁中医药大学教学实验中心 沈阳 110847；2. 辽宁中医药大学研究生学院 沈阳 110847；3. 辽宁中医药大学中西医结合学院 沈阳 110847）

线粒体产能（三磷酸腺苷，ATP）为细胞执行生物学功能提供动力；骨骼肌富含线粒体，其收缩需消耗大量ATP，线粒体损伤则收缩力下降。线粒体不仅决定细胞生存，还决定细胞死亡，这是因为氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation，OXPHOS）过程中活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）异常积累可损害其功能。对此，宿主细胞可启动线粒体自噬机制清除损伤，如不能及时清除，可诱导细胞凋亡[1，2]。前期研究发现，脾气虚证大鼠肌力下降与骨骼肌OXPHOS 损伤和自噬紊乱有关，但其是否诱导细胞凋亡尚不完全清楚[3]。中医学认为“脾气虚则四肢不用”，可治以四君子汤。四君子汤由人参、白术、茯苓、炙甘草组成，是健脾益气的代表方剂。已有研究发现，四君子汤可提高脾气虚证大鼠骨骼肌线粒体生物合成进而提高肌力[4，5]，但其对线粒体自噬的作用并不清楚，其是否影响细胞凋亡也未见报道。为此，本研究主要围绕线粒体自噬和细胞凋亡机制，以脾气虚证大鼠股四头肌线粒体为对象，探讨四君子汤治疗“脾气虚四肢不用”的机制。

1 材料

1.1 动物

50 只SPF级7 周龄雄性SD 大鼠，体质量（200 ±10）g，购于辽宁省本溪巿实验动物中心，许可证号：SCXK（辽）-2010-0001，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（辽）-2013-000-9。室温18-23℃，相对湿度45-55%，自由饮水进食，适应性饲养1周后，开始实验。

1.2 伦理审查

项目通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审核，批准号：20151205。

1.3 仪器与试剂

BCA 蛋白测定试剂盒（批号：K20316，TransGen 公司）、组织线粒体分离试剂盒（批号：C3606，Beyotime公司）、ATP 含量测定试剂盒（批号：201901，南京建成生物工程研究所）、过氧化氢检测试剂盒（批号：S0038，Beyotime 公司）、线粒体膜电位检测试剂盒（批号：C1071S，Beyotime 公 司）、LC3B 抗 体（批 号：3199111-5，Abcam 公司）、p62 抗体（批号：00052579，Proteintech 公 司）、Bcl-2 抗 体（批 号：00012789，Proteintech 公 司）、Bax 抗 体（批 号：00050599，Proteintech 公 司）、Cyt-c 抗 体（批 号：00010933，Proteintech 公司）、Caspase3 抗体（批号：00058210，Proteintech 公司）、PARP 抗体（批号：9532T-9，CST 公司）、GAPDH 抗体（批号：L10515，Proteintech 公司）、COX-4 抗体（批号：10001421，Proteintech 公司）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗（批号：7074P2，CST公司）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗鼠二抗（批号：20000002，Proteintech 公司）、ECL 化学发光试剂盒（批号：M20926，TransGen 公司）。高速冷冻离心机（Thermo Scientific）、全波长酶标仪（Tecan infinite 200Pro）、超声破碎仪、电泳仪（Bio-Rad）、转膜仪（Bio-Rad，Trans-Blot Turbo Transfer System）、显影仪（Tanon 5200）。

2 方法

2.1 动物

大鼠随机分为对照组（n=10）和脾气虚证模型组（n=40）。按文献[3,6]方法复制和评价饮食失节＋劳倦型脾气虚证模型。造模结束后，将脾气虚证模型组大鼠分为四君子汤治疗低、中、高剂量治疗组和盐水组，每组10 只，常规饲喂。人参、白术、茯苓、炙甘草购自辽宁中医药大学附属医院药房并煎煮，按成人剂量折算为大鼠灌胃中剂量（1.40 g·mL-1），× 2 为高剂量（2.80 g·mL-1），1/2 为低剂量（0.70 g·mL-1），盐水组灌胃等体积生理盐水，疗程2周。

2.2 ATP、MMP和ROS水平

按文献[3]方法裂解股四头肌组织，分别测定ATP和H2O2含量（间接评价ROS 水平）[7]；提取线粒体，测定MMPs，严格按照试剂盒说明书操作。去除线粒体的胞浆蛋白用于后续测定Cyt-c蛋白表达。

2.3 LC3B、p62、Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3和PARP蛋白表达

采用Western blot 法，其中LC3B、p62 蛋白表达使用上述线粒体提取物，Cyt-c 使用胞浆蛋白，Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3、PARP 使用总蛋白；总蛋白/线粒体裂解液裂解肌组织/线粒体沉淀；BCA 蛋白定量；以30 μg 蛋白计算加样量，SDS-PAGE 凝胶电泳；PVDF 转膜（0.25 μm）；5%BSA 封闭1 h；4℃摇床孵育16 h；TBST 洗膜；二抗孵育1 h；TBST 洗膜后化学发光显影。AlphaView SA 软件灰度分析；目的蛋白/COX-4或GAPDH计算相对表达量。

2.4 统计方法

采用SPSS17.0 统计软件，计量数据以均值±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 抓力和体质量

与对照组比较，盐水组抓力和体质量下降（P ＜0.05，P＜0.01）。与盐水组比较，低剂量组二者未见差异（均P＞0.05）；中、高剂量组抓力升高（均P＜0.01）；体质量未见差异（均P＞0.05）。与中剂量组比较，高剂量组二者未见差异（均P＞0.05）（表1）。

表1 5组大鼠抓力与体质量水平（±s；n = 10）

表1 5组大鼠抓力与体质量水平（±s；n = 10）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与盐水组比较，##P ＜0.01

对照组盐水组低剂量组中剂量组高剂量组抓力/g 1835.2±195.151453.0±319.59**1507.6±198.501668.6±215.95##1731.6±263.74##体质量/g 396.58±15.96310.36±18.59*299.89±12.51303.02±13.60300.74±12.55

3.2 ATP、MMP和H2O2水平

与对照组比较，盐水组股四头肌ATP、MMP 水平下降（均P＜0.001），H2O2水平升高（P＜0.05）。与盐水组比较，低剂量组三者未见差异（均P＞0.05）；中、高剂量组ATP、MMP 水平升高（P＜0.01或P＜0.001），H2O2水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。与中剂量组比较，高剂量组ATP、MMP 水平未见差异（均P＞0.05），H2O2水平下降（P＜0.05）（表2）。

表2 5组大鼠股四头肌ATP、MMP和H2O2水平（±s；n = 6）

表2 5组大鼠股四头肌ATP、MMP和H2O2水平（±s；n = 6）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，***P ＜0.001；与盐水组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###P ＜0.001；与中剂量组比较，△P ＜0.05

对照组盐水组低剂量组中剂量组高剂量组ATP（μM）11.20±0.664.12±0.15***4.54±0.299.36±1.01###9.47±1.04##MMP 4.838±0.4891.937±0.576***2.030±0.5003.670±0.178##3.800±0.561##H2O2（μM）1.134±0.1981.532±0.138*1.206±0.1841.030±0.149#0.809±0.127##△

3.3 LC3B、p62蛋白表达

Western blot 实验结果显示，与对照组比较，盐水组股四头肌LC3B-II 蛋白表达升高（P＜0.05），p62 表达下降（P＜0.001）。与盐水组比较，低剂量组二者表达未见差异（均P ＞0.05）；中、高剂量组LC3B-II 表达下降（均P＜0.05），p62 表达升高（均P＜0.05）。与中剂量组比较，高剂量组二者表达未见差异（均P ＞0.05）（图1、表3）。

图1 5组大鼠股四头肌LC3B及p62蛋白印迹分析

表3 5组大鼠股四头肌LC3B及p62蛋白相对表达量（±s；n = 4）

表3 5组大鼠股四头肌LC3B及p62蛋白相对表达量（±s；n = 4）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，***P ＜0.001；与盐水组比较，#P ＜0.05

对照组盐水组低剂量组中剂量组高剂量组LC3B 0.977±0.1121.174±0.118*1.211±0.1790.920±0.125#1.007±0.146#p620.470±0.0650.252±0.016***0.241±0.0340.412±0.034#0.497±0.017#

3.4 Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3、PARP 蛋白表达

Western blot 实验结果显示，与对照组比较，盐水组股四头肌Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3 和PARP 蛋白表达升高（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），Bcl-2表达下降（P＜0.001）。与盐水组比较，低剂量组各蛋白表达未见差异（均P＞0.05）；中、高剂量组Bax、Cytc、cleaved-Caspase3 和PARP 表达下降（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），Bcl-2 表达升高（均P＜0.01）。与中剂量组比较，高剂量组Bax 表达下降（P＜0.01），其余表达未见差异（均P＞0.05）（图2、表4）。

4 讨论

前期研究发现，脾气虚证模型大鼠肌力下降，但四君子汤对其是否具有修复作用并不清楚[3]。为此，我们检测了不同浓度四君子汤对脾气虚证模型大鼠抓力的影响。实验结果表明，中、高剂量四君子汤能够提高大鼠肌力。

线粒体产能是细胞执行生物学功能的基础，也是“脾主肌肉”的重要环节，骨骼肌富含线粒体，其收缩需消耗大量ATP，线粒体损伤则收缩力下降。前期研究发现，脾气虚证模型大鼠呼吸链代谢产物ATP、MMP 水平下降，H2O2水平升高，推测四君子汤可能通过影响呼吸链代谢提高肌力。为此我们进一步检测了不同浓度四君子汤治疗脾气虚证模型大鼠股四头肌ATP、MMP 和H2O2水平。实验结果表明，中、高剂量四君子汤均能减少ROS 积累，恢复MMP 并提高线粒体产能，不仅如此，高剂量四君子汤对ROS 的清除作用更加显著。

表4 5组大鼠股四头肌Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3及PARP蛋白相对表达量（±s；n = 4）

表4 5组大鼠股四头肌Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3及PARP蛋白相对表达量（±s；n = 4）

对照组盐水组低剂量组中剂量组高剂量组Bcl-20.731±0.0670.452±0.048***0.529±0.1170.628±0.143##0.620±0.102##Bax 0.533±0.0811.018±0.166***0.992±0.1770.751±0.185##0.430±0.040###△△Cyt-c 0.879±0.1011.017±0.119*0.890±0.0780.812±0.114#0830±0.129#Caspase30.288±0.0320.433±0.081**0.430±0.0110.309±0.023#0.275±0.051#PARP 0.704±0.0961.002±0.177**1.025±0.1610.800±0.100#0.676±0.099##

MMP正常是线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的先决条件，维持其稳定有利于发挥细胞的正常生理功能；ROS 作为线粒体代谢副产物，其异常积累可组成攻膜复合体，损害MMP进而影响产能，如持续积累，可诱导细胞凋亡。对此，细胞可启动线粒体自噬机制清除损伤，维护内环境稳态[8，9]。我们的研究发现脾气虚证模型大鼠股四头肌线粒体自噬紊乱，但细胞凋亡情况不明，四君子汤是否能够影响自噬和凋亡机制也并不清楚。

线粒体自噬是细胞选择性降解损伤线粒体的分解代谢过程。LC3B 是自噬过程中的特异性信号蛋白，其具备两种空间构象，在自噬发生时，LC3B-I 与PE 泛素样结合并转变为LC3B-II，LC3B-II 与下游自噬相关受体结合，启动自噬过程；而p62作为自噬的底物常与LC3B-II 共同作为衡量自噬流的标准[10-12]。适度水平自噬有利于维持能量供应及细胞内环境稳态，但当线粒体损伤严重时，线粒体无法通过有效自噬清除损伤，自噬紊乱可导致凋亡因子如Cyt-c 等释放入胞浆，进而诱导细胞凋亡[13]。实验结果表明，脾气虚证模型大鼠股四头肌线粒体自噬水平升高，经中、高剂量四君子汤治疗后线粒体自噬水平下降。该结果提示，脾气虚状态下股四头肌线粒体自噬水平上调，但过度自噬并未提高OXPHOS 功能，该结果也证明适度自噬能够应对应激，而过度自噬将损害线粒体网络。经中、高剂量四君子汤治疗后线粒体维持基础自噬水平，推测四君子汤可能通过减少过度自噬并维持适度自噬进而降低ROS 积累，恢复MMP 并提高线粒体产能，最终导致线粒体网络恢复正常。

抗凋亡蛋白Bcl-2 及促凋亡蛋白Bax 均为Bcl-2家族成员。Bax 是线粒体应激引起细胞凋亡的关键组分，受凋亡性刺激后，Bax 形成寡聚体并转位至线粒体膜，增加膜的通透性并导致Cyt-c 释放，进而激活caspase 途径，启动细胞凋亡；而Bcl-2 能够通过改变Bax 空间构象抑制细胞凋亡[14，15]。Caspase 3 是凋亡的关键执行者，Cleaved-Caspase3 是其活化形式，而PARP作为应激环境下通过DNA修复维持细胞生存能力的重要因子，是体内Caspase-3 的主要剪切靶标之一。因此，PARP 的剪切和Cleaved-Caspase 3 活化可作为衡量细胞凋亡水平的标志[16]。实验结果表明，脾气虚证模型大鼠股四头肌细胞凋亡水平升高，经中、高剂量四君子汤治疗后细胞凋亡水平下降；不仅如此，高剂量四君子汤还能显著降低Bax 表达和ROS 水平。提示脾气虚状态下过度自噬并未修复线粒体损伤，不仅如此，线粒体应激还导致Bcl-2/Bax失衡，Cytc 释放并诱导细胞凋亡。经中、高剂量四君子汤治疗后，Bcl-2/Bax 恢复平衡，Cyt-c 释放减少，细胞凋亡水平下降。

线粒体自噬调控机制复杂，研究发现，多种信号通路可介导不同种类的自噬过程，如PINK1/Parkin 依赖的膜电位降低引起的线粒体自噬；与细胞死亡有关的蛋白Bnip3/Nix 介导的线粒体自噬及FUNDC1 参与缺氧介导的线粒体自噬[17]。但何种机制介导脾气虚骨骼肌自噬紊乱，四君子汤是否直接调控线粒体自噬又是怎样诱导细胞凋亡还并不清楚。因此，这也是本课题组后续研究重点关注的领域。本研究认为，四君子汤可能通过抑制过度线粒体自噬，维持适度自噬改善线粒体应激，降低细胞凋亡水平治疗脾气虚四肢不用。