冠心病血瘀证蛋白组学研究的系统综述＊

傅梦薇，刘咏梅，陈恒文，周思远，刘兰椿，李洪峥，何浩强，王 阶＊＊

（1. 中国中医科学院广安门医院 北京 100053；2. 北京中医药大学研究生院 北京 100029）

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是指冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或阻塞导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，目前已成为全球亟待解决的重大卫生问题，属中医“胸痹心痛”范畴[1]。病证结合是中西医结合临床的重要研究方法，自20 世纪70年代以来，我国开展了冠心病的中医证候研究，确立了证候诊断标准，为后续的中药临床药效研究及新药试验提供了支撑。陈可冀院士认为血瘀是冠心病的主要病机，并提出运用中医药活血化瘀治法治疗冠心病[2]。冠脉造影或冠状动脉血管成像等检查手段证实冠心病患者均存在冠状动脉狭窄，根据中医证候积分可发现均符合血瘀证诊断标准，故普遍认为血瘀证是冠状动脉狭窄的病理基础[3]。近年来，众多学者聚焦于冠心病血瘀证的证候客观化临床研究[4]，尤其是微观层面的基因组学与证候之间的关联，极大地推进了证候的客观化研究，如围绕miRNA 进行的转录组学研究就被认为是21 世纪生物学领域的重大进展。与基因组学研究相比，蛋白质组学研究主体为生物大分子并作为疾病诊断标记物，而非DNA和RNA。目前心血管领域对冠心病血瘀证蛋白组学的研究仍处于起步阶段，多着眼于鉴定其蛋白组学特点、中医药干预的疗效监测等，研究方法多种多样，主要有：①冠心病血瘀证患者与健康人对照；②冠心病血瘀证与非血瘀证患者对照；③冠心病血瘀证、非血瘀证患者与健康人三者对照。由于研究方法存在差异，研究者对冠心病血瘀证存在的相关蛋白与涉及的病理过程等方面仍存在争议。为此，本研究对冠心病血瘀证蛋白组学研究方法及其结果进行评价分析，以期为未来研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 文献检索策略

计算机检索中国知识资源总库（CNKI）、中国学术期刊数据库（Wanfang Data）、Cochrane、Medline。检索范围均为建库-2020年2月公开发表的与冠心病血瘀证蛋白组学相关的临床试验或基础研究。采用专业检索，根据不同数据库制定具体检索式（详见附录）。中文检索词：冠状动脉粥样硬化性心脏病、冠心病、血瘀、心脉瘀阻、胸痹、蛋白；英文检索词：Coronary artery disease，Coronary atherosclerosis disease，Blood Stasis，Proteomics。

1.2 文献纳入标准

①文章类型：采用随机对照设计的中英文研究，无论是否采用盲法或分配隐藏；②受试者：满足2016年中国中西医结合学会制定的《冠心病血瘀证诊断标准》的患者，年龄构成、性别比例、病程不限；③主要结局：差异蛋白质的种类及表达水平。

1.3 文献排除标准

①综述或述评；②动物实验；③重复发表的文献；④血瘀证合并其他证候；⑤未采取蛋白组学方法；⑥会议论文。

1.4 文献纳入筛选

将数据导入NoteExpress3.2.0 进行查重管理。阅读文章标题和摘要，剔除主题不相关文献，然后下载并阅读全文，严格根据纳入与排除标准进一步筛选。

1.5 资料提取

由2名评价员（傅梦薇、周思远）独立按照事先设计的表格提取符合纳入标准的文献资料，当意见不一致时通过讨论协商或向第3位研究员（刘兰椿）咨询解决。

2 结果

2.1 文献检索及筛选结果

初步检索获得文献259 篇，其中包括中国知网的140 篇、万方数据库的91 篇、Medline 数据库的12 篇、Cochrane数据库的16篇，利用NoteExpress 查重剔除重复33 篇，剩余文献226 篇。对剩余文献阅读文题和摘要初筛，删除111 篇与研究内容不符的文献，剩余115篇文献进行阅读全文复筛。全文复筛后排除101篇文献，其中综述或述评13 篇、动物实验9 篇、临床资料重复15 篇、合并其他证候35 篇、未采取蛋白组学技术25篇、会议论文4 篇，最终纳入定性分析的文献数为14篇，均为原始研究（图1）。

2.2 文献基本特征

根据纳入研究的16篇文献显示，目前寻找差异蛋白的冠心病血瘀证蛋白组学研究方法有以下3种：①将冠心病血瘀证患者与健康人进行对照；②将冠心病血瘀证患者与冠心病非血瘀证患者进行对照；③将冠心病血瘀证患者、冠心病非血瘀证患者、健康人三者进行对照。从样本大小、检测内容、技术手段、差异蛋白质点及表达水平、差异蛋白质介导的生物学过程等进行信息提取与分析（表1）。

表1 纳入蛋白组学研究的文献基本特征

续表1

图1 文献检索流程图

2.3 涉及病理机制

从纳入文献的蛋白组学研究结果来看，冠心病血瘀证可能涉及炎症反应、凝血系统异常与脂代谢紊乱等病理机制（表2）。

表2 涉及病理机制代谢途径的主要差异蛋白种类及表达水平

2.3.1 炎症反应

hs-CRP、Haptoglobin、α1-Antitrypsin、Fibrinogen、Vitamin D-Binding Protein 与sICAM-1 是冠心病血瘀证最关键的表达水平升高的6种差异蛋白（图2）。

hs-CRP 是反映炎症的重要指标，可上调粘附因子表达并促进炎症因子分泌，黏附因子sICAM-1 的表达水平可反映粥样斑块的局部量；炎症因子通过细胞因子作用损伤血管内皮，使NO 失活分解并释放大量的自由基，进一步损伤内皮细胞，引起血管痉挛、脂质代谢失常。此外，CRP 的升高促进可巨噬细胞摄取LDL，将其转化为泡沫细胞，可同样增加粥样斑块。以上过程共同促进动脉粥样硬化的形成，最终造成心肌缺血、缺氧，心肌细胞损伤，引发冠心病的产生。因此，CRP 与sICAM-1 联合在增加淋巴细胞迁移至病灶的过程中发挥作用，是与动脉粥样硬化发生、演变和进展重要的促炎因子[19-21]。Haptoglobin 作为一种急性时相反应蛋白，具有抗氧化、抗菌等作用，表达水平与炎症反应呈正相关[22]。α1-Antitrypsin 与Fibrinogen 也是急性时相反应蛋白，具有抗炎、抗凋亡的机体保护作用，两者表达量的升高说明炎症反应的发生。Vitamin D Binding Protein 是肝脏实质细胞分泌的蛋白质，可结合Vitamin D 和肌动蛋白，在炎症反应中起到一定作用[23]。Transthyretin 含量与炎症反应呈负相关，可能是机体代谢失常的潜在标志物[24]。这些与炎症相关的蛋白质的表达水平差异反映出冠心病血瘀证存在炎症反应。

2.3.2 凝血系统异常

现代研究认为，血瘀证证候的形成可能与凝血-纤溶系统异常导致的血液高凝状态、血栓形成等密切相关，故在冠心病血瘀证的蛋白组学研究中，凝血-纤溶系统相关蛋白是比较重要的研究方向[25-26]。血小板微粒PMPs、血小板表面膜糖蛋白CD62p、血小板激活复合物PAC-1、白细胞分化抗原CD40L、CD41、GMP-140、Actinγ、PAI-1、t-PA 等是冠心病血瘀证与凝血过程关系密切的主要差异蛋白（图3）。

图2 炎症反应差异蛋白作用途径

图3 凝血-纤溶系统差异蛋白作用途径

PMPs 具有黏附、聚集血小板及促炎症反应的作用；PMPs 表达CD62p 后可使血小板活化，从而形成血栓，研究表明CD62p 浓度与血瘀证积分呈显著正相关[27]；PAC-1 与Fg 结合后协助血小板聚集，进一步促进凝血过程；CD40L 主要作用是促进白细胞聚集，还可结合其受体CD40 从而激活血小板，进而推动促凝血过程；CD41和β3以结合后形成αⅡb-Ⅲa，是血小板最重要的膜受体，故CD41 表达水平可反映出血小板聚集程度；GMP-140 在血小板活化时从α颗粒转移到膜上，标志着血小板活化，故在血栓性疾病发病过程中显著升高；Actinγ是血小板骨架蛋白的组成部分，有推测认为其在冠心病血瘀证患者血液中上调是为了在血小板完全活化前为后续血小板分泌、变形、移动做准备；PAI-1 是PA 的主要生理抑制物，能灭活t-PA活性，阻断纤溶酶原激活，从而促进凝血。以上8种差异蛋白均与血小板参与凝血反应呈正相关，可通过影响血小板形态变化、血小板间、血管内皮细胞与血小板的粘附迁移来起到促凝血作用，其表达水平的上调标志着凝血过程处在亢进阶段。而t-PA 作为纤溶系统标志物，可反应血液中纤溶活性大小，纤溶系统可防止体内血栓形成，与凝血系统处在平衡状态已维持机体正常状态，故t-PA的表达水平与凝血活性呈负相关。在冠心病血瘀证患者血液中出现明显的t-PA 表达下调，代表其纤溶活性下降，凝血活性增加，从而促进血管内凝血和血栓形成。

2.3.3 脂代谢紊乱

在纳入的14项研究中，发现与脂代谢相关的差异蛋 白 主 要 有ApoA-I、ApoA-IV、ApoJ（Clusterin）与APO-B1004种（图4）。

ApoA-I 是HDL 的主要成分，其表达水平可代表HDL 的含量；ApoA-IV 可介导肝细胞结合HDL，利于胆固醇的逆向转运及细胞内脂质外排；ApoJ（Clusterin）存在于HDL 和VHDL 中，同样可促进胆固醇外流，协同HDL 起到抗动脉粥样硬化的作用。APO-B1005具有维持LDL 结构、识别LDL 受体和正向转运Cho l等作用，故其表达水平与LDL呈正相关。故ApoA-I、ApoA-IV、ApoJ 的表达水平与冠心病血瘀证严重程度呈负相关，APO-B1005 表达水平与其呈正相关。此外，临床常用APOA1/APOB100 作为冠心病防御因子（HDL）/危险因子（LDL）之比，比单独测定APOA1 和APOB100 更有意义，当其比值＜1 时可认为是冠心病的危险指标[28]。冠心病血瘀证患者的前三项差异蛋白表达水平均比健康人降低，且APOA1/APOB100比值也已下降至＜1的水平，可见冠心病血瘀证存在脂代谢紊乱，这可能与冠心病动脉粥样硬化过程相关，与血瘀证的证候特异性还需进一步研究证实。

图4 脂代谢过程差异蛋白作用途径

2.3.4 其他生物学过程

除上述差异蛋白外，在冠心病血瘀证中上调的其他蛋白还有Serum albumin、Retinol-blinding protein4等。Serum albumin 在人体内血液内含量丰富，参与多种代谢过程，心肌缺血发作时部分Albumin 的N-末端受损或被铜占据，可以做为急性心肌缺血的一种生化标志物。目前关于Retinol-blinding protein4 的国内外研究较少，认为其血清水平与动脉粥样硬化呈正相关，具体作用机制尚不清晰[29]。故冠心病血瘀证的可能病理机制还包括心肌缺血、动脉粥样硬化等。

2.4 中医药干预影响相关蛋白的表达

方证结合是中医药疗法的显著特点，将蛋白组学研究技术和策略结合方证对应思想，不仅能观察中药治疗冠心病血瘀证前后相关蛋白的表达差异，还能探索某些药物的作用靶点与作用机制，从而为中药疗效提供证据支持[30]。

治疗冠心病血瘀证常采用活血化瘀、温阳行气等治法。研究显示，用于治疗胸痹、心痛等心系疾病的部分中药或中药有效成分干预冠心病血瘀证后在蛋白组学方面显示出一定的影响。李荣军等[31]用丹参酮ⅡA 磺酸钠注射液治疗冠心病不稳定型心绞痛血瘀证，在治疗前后运用标记免疫荧光抗体技术对进行血小板膜糖蛋白检测，发现治疗后反映血小板黏附聚集作用的血小板膜糖蛋白CD63 和PAC-1 表达水平明显上调、CD42b表达水平明显下调，表明丹参酮ⅡA 磺酸钠注射液可降低冠心病血瘀证患者的血小板活化功能，抑制凝血过程，有效缓解血瘀证症状，与丹参的活血化瘀作用不谋而合。王军[32]等用谷红注射液治疗冠心病血瘀证患者12天后，采用免疫比浊法检测血浆差异蛋白，发现反映动脉粥样硬化与炎症反应的CD62p和hs-CRP 均显著下降，表明谷红注射液具有抗炎、抗血栓形成的功效，其中医证候疗效有效率高达90%，说明谷红注射液在缓解血瘀证症状方面作用显著，亦充分验证了中药红花活血祛瘀、理气通经的功效。

3 讨论

疾病的发生发展过程通常由于基因、外界刺激等因素的共同作用，且均伴有相关生物学过程特异蛋白质表达差异。在冠心病蛋白组学方面，国内外学者已有部分研究成果（如发现人类血浆HDL 有近50种独立的蛋白成分）[33-35]，但在冠心病证具体证候蛋白组学方面仍处于初步阶段。冠心病血瘀证作为冠心病最关键的中医证型，寻找其病证结合诊断标记物或预后因子是心血管领域的重要研究方向，运用蛋白组学技术方法来寻找冠心病血瘀证的蛋白标记物可为其诊断、治疗与预后起到不可估量的作用。

研究者汇总冠心病血瘀证蛋白组学研究进行筛选后纳入14篇高质量文献。根据纳入文献显示，目前寻找差异蛋白的冠心病血瘀证蛋白组学研究方法有以下3种：①冠心病血瘀证患者与健康人对照；②冠心病血瘀证与非血瘀证患者对照；③冠心病血瘀证、非血瘀证患者、健康人三者对照。检测相关蛋白的技术方法包括双向凝胶电泳、质谱鉴定、ELISA 法、免疫比浊法、发色底物法等，检测到与冠心病血瘀证相关的差异蛋白种类繁多，涉及病理机制亦不尽相同。主要与炎症反应、脂代谢紊乱、凝血-纤溶系统异常等病理机制相关，与心肌损伤与动脉粥样硬化或存在密切关系。

综合分析上述研究结果，可见将冠心病血瘀证患者与健康人进行对照的研究方法目前最为常用，因其检测手段方便易行，得到的差异蛋白种类较多，涉及的病理机制也最为丰富，包括炎症反应、脂代谢紊乱、凝血-纤溶系统异常、心肌损伤、动脉粥样硬化等，但结果可能包含冠心病相关蛋白，而非血瘀证证型相关蛋白；对照冠心病血瘀证患者与非血瘀证患者的研究较少，检测手段相对复杂，得到的差异蛋白种类虽多但主要涉及凝血-纤溶系统异常，可见其对血瘀证的特异度较高，不过可能会排除部分差异蛋白从而遗漏一些重要的病理过程，而且冠心病非血瘀证只是排除了血瘀证的诊断，可能包含其他中医证型，不能排除得到的差异蛋白实则为其他证型（如气虚证、痰浊证）的相关蛋白而非血瘀证，需进一步与其他证型相关蛋白进行对比；将冠心病血瘀证患者、冠心病非血瘀证患者、健康人进行对照的研究数量介于以上2种研究方法之间，其检测手段主要为免疫比浊法、ELISA法等，得到的差异蛋白数量较少，涉及的病理机制主要为免疫反应、脂代谢紊乱、凝血系统异常3种，既可避免第1种方法中证候特异性低的问题，也可通过健康对照来排除其他证型相关蛋白，故得到的结果相对准确，代表性较高。

本研究创新性地汇总分析了近年来冠心病血瘀证蛋白组学的具体研究方法，并根据不同的研究方法探索其对差异蛋白结果及涉及病理机制的影响，有助于今后临床研究者对于冠心病血瘀证的进一步探索，对于临床诊断与治疗具有指导意义。故在今后冠心病血瘀证蛋白组学研究中，推荐临床科研人员根据研究内容选择合适的研究方法进行研究设计，应更加着眼于涉及病理机制中重要信号通路内关键蛋白的表达，从而精准服务于中西医病证结合的诊断、治疗与预后过程。