冠心病血瘀证代谢组学研究进展＊

周思远，熊兴江，何浩强，2，陈恒文，傅梦薇，2，刘兰椿，2，王 阶＊＊

（1. 中国中医科学院广安门医院 北京 100053；2. 北京中医药大学研究生院 北京 100029）

冠心病（Coronary heart disease，CHD）是目前患病率与死亡率最高的疾病之一，已成为重大的公共卫生问题。现代医学在缓解症状与改善远期预后方面有较好疗效，但也存在二级预防药物治疗不耐受等问题[1]。中医药治疗冠心病已积累了数千年的经验，早在《金匮要略·胸痹心痛短气病》便有记载，现代病证结合理论下的冠心病中医防治更是为提高临床疗效提供了新的方法。血瘀证是CHD 最主要证型之一[2]，活血化瘀是其基本治法。然而，目前关于冠心病血瘀证的发生机制以及活血化瘀中药的作用机制研究仍未深入，一定程度上限制了中医药在冠心病的临床应用与研究。因此，利用现代科学技术客观化地阐明“冠心病-血瘀证-活血化瘀中药”诊疗体系的科学内涵具有重要意义。代谢组学能将基因组、蛋白质组学变异以及环境因素变化有效桥接，从最终的“生化表型”来把握生物体的整体功能状态[3]。通过发掘CHD发病过程中的关键代谢物，进一步探索其生物学作用，可为CHD 发病机制的研究提供新思路。此外，代谢组学技术能通过对机体代谢组的识别和量化研究，系统展示机体正常生理或病理刺激下的动态变化规律，为CHD 血瘀证的生物学基础与活血化瘀中药作用机制的揭示提供了有力工具[4]。

1 冠心病代谢组学研究概述

利用代谢组学开展冠心病研究已有数十年，最早用于生物标志物的探索，近年来已转向发病机理与药效机制的研究。随着技术革新，目前应用于代谢组学研究的方法包括核磁共振技术（Nuclear magnetic resonance，NMR）、液相色谱质谱联用技术（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技术、气相色质谱联用技术（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）等。利用这些技术，学者们已发现较多的可用于CHD 诊断的潜在生物标志物，同时，通过进一步的细胞功能学与药理学研究，分析了这些可能的标志物在CHD 病理机制中的作用。已发现与CHD 相关的代谢物包括N乙酰神经氨酸[5]、氧化脂质[6]、不饱和脂肪酸[7]、苯乙酰谷氨酰胺[8]、磷脂酰胆碱[9]、氨基酸[10]、二十碳五烯酸[12]等。

研究发现体内代谢物可能与冠心病发生风险相关。一项研究对2324 例接受冠脉造影者的血浆代谢物进行检测，鉴定出36个CHD相关代谢产物，其中N-乙酰神经氨酸水平与冠心病事件呈显著正相关关系。进一步研究发现N-乙酰神经氨酸能通过激活Rho/ROCK-JNK/ERK 信号通路诱发心肌损伤[5]。另一研究发现了5个与绝经期妇女患冠心病风险相关的氧化脂质，包括2种羟基磷脂酰胆碱以及花生四烯酸的3种氧化衍生物（15-HETE、5-HETE 和11-HETE），色谱分析显示HETE 谱与花生四烯酸的非酶氧化机制一致[6]。

体内代谢物还与不良心血管事件风险相关。一项涉及7256 例人群的前瞻性队列研究发现血浆中较高的单不饱和脂肪酸、苯丙氨酸水平与心肌梗死等不良心血管事件风险正相关，而较高水平的二十二碳六烯酸、omega-6脂肪酸与低风险相关[7]。另一项研究则发现苯乙酰谷氨酰胺与心肌梗死等主要不良心血管事件相关，药理学研究提示，其作用可能与其通过G蛋白偶联受体介导血小板高反应性有关[8]。

代谢物可作为CHD 的潜在生物标志物。一项研究发现溶血磷脂酰胆碱、皮质醇和甘油磷脂酰胆碱可用于区分冠心病患者与健康者[9]。有研究发现2-异丙基苹果酸，5-羟基吲哚乙醛，4-羟基马尿酸和腺苷可作为冠心病潜在的生物标志物，涉及的信号通路包括氨基酸代谢和脂肪酸代谢等[10]。另有学者筛选出溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、单酸甘油酯等9种代谢物作为冠心病诊断的潜在生物标志物，基于上述代谢物建立的CHD 预测模型显示出良好的CHD 风险预测能力[11]。

干预代谢物水平或能抑制动脉粥样硬化进展。有学者发现经ω-3 多不饱和脂肪酸饮食喂养的小鼠动脉粥样硬化斑块面积小且稳定，其体内二十碳五烯酸代谢物——18-羟基二十五碳烯酸、17,18-环氧二十碳四烯酸水平升高。进一步研究发现这些代谢物可以通过NF-kB 信号通路减少内皮细胞活化，抑制动脉粥样硬化进展[12]。

2 基于代谢组学的冠心病血瘀证生物学基础

近年来，学者们从理化指标、基因组学、表观遗传学等不同层面探索了冠心病血瘀证的生物学基础[1]，但仍未完全阐释其发生机制。代谢组学可以从整体揭示生命活动的调控规律，并通过探索代谢物之间的相互作用阐释机体的生理、病理机制，是揭示证候本质的有效途径[4]。目前研究者已初步筛选出一些CHD血瘀证的潜在生物代谢标志物，包括葡萄糖、丙氨酸、柠檬酸等（表1）。

2.1 基于“同病异证”的冠心病血瘀证代谢物研究

“同病异证”是中医临床诊断的特色，明确证候的鉴别是临床治疗的关键。气为血之帅，气虚与气滞是导致血瘀证形成的常见因素，探讨CHD 不同血瘀证辨证分型的物质基础对CHD 血瘀证证候本质的把握具有重要意义。研究显示CHD 心血瘀阻证与气虚血瘀证患者血浆代谢物存在差异，心血瘀阻证中柠檬酸、琥珀酸、3-羟基丁酸、谷氨酸等含量升高，不饱和脂肪酸、组氨酸等含量降低，气滞血瘀证患者的血浆代谢产物谱与心血瘀阻证患者无明显差异[13]。然而，另一项研究发现CHD 气滞血瘀证与气虚血瘀证存在氨基酸水平的差异，组氨酸、瓜氨酸等含量在CHD 气虚血瘀证中升高[14]。另有研究显示，溶血磷脂酰胆碱，亚油酸、花生四烯酸、鞘氨醇类物质构成了CHD 气虚血瘀证代谢产物谱[15]。

血不利则为水，瘀血与痰浊常相互胶结共同为病，在病情复杂时有难以区分之弊，探索导致二者差异的物质基础，对临床精准辨证及“同病异治”内涵的揭示具有重要意义[16]。研究发现冠心病血瘀证和痰浊证既有共性代谢物，也有特异性代谢物，特异性代谢物主要有苹果酸、葡萄糖、甘氨酸、棕榈烯酸等，其中苹果酸、葡萄糖等在血瘀证中含量较痰浊证升高[17]。另一项研究显示CHD 血瘀证和痰浊证患者血浆的差异代谢物主要涉及氨基酸代谢（亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸），嘌呤代谢（尿酸、泛醌）和嘧啶代谢（脱氧尿嘧啶核苷酸、尿苷）[18]。CHD 血瘀证与痰浊证患者的尿液代谢物也存在一定差异，血瘀证尿液中柠檬酸、葡萄糖、肌酐、氧化三甲胺、马尿酸等含量低于痰浊证，而胆汁酸、组氨酸的含量高于痰浊证组[19]。以上研究提示，代谢组学技术在CHD 血瘀证与其他证型鉴别方面有较大应用前景。

表1 冠心病血瘀证潜在生物代谢标志物

2.2 基于“异病同证”的冠心病血瘀证代谢物研究

“证同治同，异病同治”是中医临床的重要治则，比较冠心病血瘀证与其他疾病血瘀证相关代谢物的异同，有利于进一步明确CHD 血瘀证形成的物质基础并全面揭示血瘀证的证候内涵。近年来研究发现，丙氨酸[20,21]、乳酸[20,21]、葡萄糖[20-22]、柠檬酸[20,23]、组氨酸[23]、缬氨酸[21,24]等可作为CHD 血瘀证潜在生物代谢标志物。相关学者在慢性心力衰竭[25]与2 型糖尿病[26]血瘀证患者的血浆代谢产物谱中发现了相似代谢物，其中丙氨酸、乳酸、缬氨酸、丙酮酸等构成了慢性心力衰竭血瘀证血浆代谢产物谱[25]，丙酮、甘氨酸、柠檬酸、延胡索酸等代谢物含量的异常构成了2型糖尿病血瘀证患者代谢特征[26]。此外，有学者利用UHPLC-TOF-MS 联用技术分析了CHD 血瘀证与肝硬化血瘀证异病同治的物质基础，结果显示柠檬酸、组氨酸、羟基丁酸、谷氨酰胺等7种内源性代谢物为血瘀证的潜在生物标志物[27]。

尿液是人体代谢终产物，冠心病血瘀证患者也存在特异性的尿液代谢物，柠檬酸、丙氨酸、葡萄糖、缬氨酸等代谢物含量的异常构成了不稳定性心绞痛血瘀证患者的代谢组学特征[28]。另有学者在乙肝肝硬化血瘀证患者的尿液代谢产物谱中也发现了相似代谢物，乙肝肝硬化血瘀证的潜在代谢标志物主要包括柠檬酸、丙氨酸、D-葡萄糖、甘氨鹅脱氧胆酸等[29]。以上结果提示，丙氨酸、柠檬酸、乳酸、葡萄糖等代谢物含量的异常可能是导致血瘀证形成的小分子物质基础。

3 基于代谢组学的活血化瘀中药作用机制

方证对应是中医临证的基本思维模式，活血化瘀是治疗CHD 血瘀证的基本治法，但相关活血化瘀中药干预CHD 血瘀证的作用机制尚未阐明，一定程度上影响了中药在临床的应用。代谢组学技术能够揭示药物作用于机体产生的复杂代谢产物组变化，并提供药物作用途径和作用靶点等方面的信息，可为阐明活血化瘀中药药效机制提供新的手段[30]。已有研究发现，血府逐瘀胶囊[31]、血府逐瘀汤[32,34]、复方丹参滴丸[33]、心可舒片[35]、桃红四物汤[36]、血栓心脉宁片[37]、麝香保心丸[38]等活血化瘀中药可以通过影响一些体内关键代谢物及信号通路，调整脂肪酸、磷脂、胆汁酸、氨基酸等物质代谢发挥改善心肌能量代谢、调整脂质代谢、抑制磷脂过氧化、影响类固醇激素生物合成等作用，这些关键代谢物及代谢通路的发现也有望为CHD 血瘀证的治疗提供靶点。

活血化瘀中药干预CHD 血瘀证与改善心肌能量代谢密切相关。一项研究利用UPLC-QTOF/MS 技术发现血府逐瘀胶囊纠正了CHD 血瘀证大鼠体内肉碱酯酰转移酶1 蛋白的过表达，使L-肉碱、游离脂肪酸、乙酰肉碱含量增加，提示血府逐瘀胶囊能减轻心肌细胞的过度消耗状态，并提供正常能量供应[31]。血府逐瘀汤则能促进脂肪酸β氧化及糖酵解产生ATP供能并保护心肌细胞，其促进脂肪酸β氧化与下调脂肪酸、四羧酸和顺式乌头酸相关，其促糖酵解与下调2-脱氧葡萄糖减轻对N-糖基化和糖酵解的抑制作用相关[32]。此外，复方丹参滴丸亦可通过调节心脏能量代谢改善心肌缺血，柠檬酸和3-羟基丁酸可能是复方丹参滴丸潜在的治疗靶点[33]。

活血化瘀中药还可以调节脂质代谢，抑制磷脂过氧化。研究显示血府逐瘀汤可以上调鸟脱氧胆酸和糖胆酸促进胆汁酸代谢增加胆固醇流出而调节血脂；同时通过下调溶血磷脂酸含量，抗血小板聚集和血管平滑肌收缩[34]。血府逐瘀胶囊主要通过纠正磷脂酶A2 的过表达，降低溶血磷脂酰胆碱含量，减少磷脂过氧化物含量[31]。靶向干预脂肪酸、磷脂代谢可能是活血化瘀中药发挥作用的重要机制之一，研究显示，心可舒片可使心肌梗死大鼠的异常代谢物趋于正常，其中L-乙酰肉碱、鞘氨醇、花生四烯酸等13种代谢物与脂质代谢相关[35]。桃红四物汤也主要通过调节脂肪酸、甘油磷脂代谢发挥治疗作用，甘油磷胆碱、马尿酸、吲哚基硫酸盐等可能是桃红四物汤潜在的抗凝、降脂作用靶点[36]。

活血化瘀中药的治疗作用与影响类固醇激素的生物合成相关。研究显示血栓心脉宁片可以通过调节CHD 血瘀证大鼠皮质酮、3α,21-二羟基-5β-孕烯-11,20-二酮等代谢物含量，影响类固醇激素生物合成[37]。麝香保心丸则可以通过抑制皮质酮、醛固酮、皮质醇和肾上腺素等类固醇激素的生物合成，降低与心肌肥大有关的代谢产物的水平，逆转急性心肌梗死的病理改变[38]。

4 小结与展望

综上，代谢组学技术可以从整体的“生化表型”来把握生物体的整体功能状态，在CHD 血瘀证病理基础及活血化瘀中药作用机制研究中发挥重要作用。现有研究成果显示，CHD 血瘀证的差异代谢物包括氨基酸、葡萄糖、有机酸等，丙氨酸、葡萄糖、柠檬酸等可作为潜在的诊断标志物，心肌能量代谢、脂质代谢、磷脂过氧化、类固醇激素生物合成可能是活血化瘀中药的主要作用途径。CHD 血瘀证的代谢组学研究虽取得上述进展，但也存在一些不足。首先，目前的代谢组学分析技术存在一定局限性，尚不能对生物体所有代谢产物进行全面定性定量分析，导致采用不同检测方法可能获得不同结果[39]。其次，尚无统一、严谨的生物样本采集与处理规范，一定程度上影响了实验结果的可靠性与可重复性[40]。此外，CHD 血瘀证生物学基础研究存在样本量不足且缺乏验证等问题，尚未形成辨证分型的统一标准。活血化瘀中药作用机制研究停留在关键代谢物及代谢通路探明阶段，药物作用下整体代谢调控网络的改变尚不明确。

针对上述问题，我们在未来的研究中可以采取如下策略：①完善目前的代谢组学检测技术，探索更为广谱、通用的代谢组学检测方法；建立统一的生物样本采集与处理规范，提高实验人员科研素养，保证实验过程的严谨性、可重复性。②扩大研究的样本量，进一步挖掘与验证CHD 血瘀证的差异代谢产物谱，探索统一的诊断和疗效评价的生物标志物；也可以从已经发现的CHD 血瘀证潜在代谢标志物出发，对这些代谢物涉及的生物合成、表达等生物学事件展开研究，深入探究其在代谢网络中发挥的作用。③充分利用现有的CHD 血瘀证基因、蛋白质等组学研究成果，将不同组学数据科学整合并系统分析，构建基于多组学技术的CHD 血瘀证的代谢调控网络。④联合应用多组学技术，建立不同组学信息间的相互联系，探索代谢物与基因、蛋白质之间的相互作用，从而系统诠释病证结合内涵，多组学技术联合应用，也有利于克服单一平台研究可能造成的实验误差[41]。⑤采用细胞代谢组学等新兴技术，部分生物过程只发生在细胞中，细胞系代谢产物谱可作为整体代谢物研究的有效补充，并可直接与基因、蛋白质组数据联用，在疾病机制与药物机理研究中前景广阔[42]。