血塞通软胶囊干预冠心病血瘀证患者lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1调控网络的临床研究＊

董 艳，陈恒文，刘咏梅，朱 爽，冯岚岚，王 阶

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

血塞通软胶囊（XST）是临床治疗冠心病血瘀证的常用药，其主要成分是三七总皂苷，它是传统活血止血中药三七的活性提取物。由于三七总皂苷包含数十种皂苷成分，作用靶点繁多，作用环节交错，作用机制复杂，故而在一定程度上限制了XST 的临床运用和疗效发挥。而现有三七总皂苷治疗冠心病的机制研究主要围绕“中心法则”的单一基因或蛋白质[1-3]，结果分散、单一，难以形成清晰、系统的调控网络。前期研究[4,5]已表明，冠心病不稳定型心绞痛血瘀证存在lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络，其中lncR CTB-114C7.4、miR-3656 是关键上游调控因子，能形成lncR CTB114C7.4-miR3656 网络，参与细胞凋亡信号通路。因此，本研究采用临床随机双盲安慰剂对照试验观察XST能否干预lncR CTB-114C7.4和miR-3656，以及细胞凋亡常见基因BCL2A1 mRNA 表达，以揭示其治疗冠心病不稳定型心绞痛血瘀证的lncRNAmiRNA-mRNA 调控网络。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入2018年2月-2019年8月中国中医科学院广安门医院心血管科门诊的冠心病不稳定型心绞痛血瘀证患者80 例。利用SPSS 23.0 软件生成随机分组方案，并进行随机方案隐藏，试验组和对照组各40 例。采用双盲设计，以实现对受试者、研究者和数据统计者的盲法。研究过程中对照组脱落2 例，皆因疗效欠佳退出；试验组病例无脱落，故实际完成试验78 人。本研究通过了伦理委员会的批准（批件号：2018-001-KY-01），并在“中国临床试验注册中心”平台完成国际注册（注册号：ChiCTR1800014980）。

1.2 纳入标准

凡符合冠心病不稳定型心绞痛血瘀证诊断标准，年龄在40-80岁之间，且签署知情同意书者均可纳入。其中，疾病诊断标准参考2014年《ACC/AHA 非ST 段抬高型急性冠脉综合征管理指南》；中医证候诊断标准则参考1986年中国中西医结合学会修订的血瘀证标准。分别由2位中级职称及以上中医师进行独立辨证，若意见不一致则参考第3 位中级职称及以上中医师的意见。

1.3 排除标准

本研究排除标准为：①心功能为Ⅲ级或Ⅳ级；②其他心血管疾病、呼吸系统疾病、或心脏神经官能症等所致胸痛；③脑梗塞急性期；④合并肝肾功能不良；⑤合并其他严重原发病（如血液病、肿瘤等）；⑥最近2周内有急性感染；⑦血压或血糖控制不良，或伴有较严重的并发症；⑧伴有精神系统疾病或智力障碍，不具备独立完成问卷调查及随访工作者；⑨孕妇或哺乳期妇女。

1.4 治疗方法

试验组给予西医基础治疗+XST，2 粒/次，每日2次；对照组给予西医基础治疗+XST 模拟剂，2 粒/次，每日2 次。导入期为1 周，疗程为4 周，导入期间停服其他具有活血化瘀作用的中药汤剂及中成药。试验组和对照组药物均由昆明圣火药业集团有限公司提供，XST的规格为0.33 g/粒，国药准字Z19990022；模拟剂的规格为0.33 g/粒，主要成分是淀粉，与XST 外观、口感保持一致。

1.5 临床观察指标

本研究的临床观察指标包括3个方面：基线指标、疗效指标和安全指标。其中基线指标为性别、年龄、吸烟、饮酒、体重指数、合并危险因素、用药情况和血运重建情况等。疗效指标为心绞痛疗效、硝酸甘油停减率、中医证候疗效及单项中医症状体征疗效。安全指标包括血常规、肝肾功能、血糖血脂及凝血功能。

1.6 检测lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 网络表达水平

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测试验组和对照组治疗前后外周血有核细胞中lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 网络的表达水平。采集患者空腹时静脉血样4 mL，置于真空抗凝采集管中。分别进行静脉血有核细胞分离与纯化、有核细胞总RNA 提取、总RNA 浓度及纯度测定、RNA 反转录和PCR扩增等实验操作。

目的基因lncR CTB-114C7.4、miR-3656和BCL2A1的引物序列如下：lncR CTB-114C7.4，上游：TAACCTTTGATGTAGCTTGGTCTC，下 游：CATCATAAGACATCACAAAGAGGA；miR-3656，上 游：GGCGGGTGCGGGGGT，下游：GTGCGTGTCGTGGAGTCG；BCL2A1，上 游：CGTCCTACAGATACCACAACCT，下游：GATGCCGTCTTCAAACTCCT。

内参基因的引物序列如下：β-ACTIN，上游：GAGACCTTCAACACCCCAGCC，下游：AATGTCACGCACGATTTCCC；U6，上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.7 统计方法

运用SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（Mean±SD）或四分位数表示。当进行两组计量资料的比较时，若符合正态分布，采用两独立样本t检验或配对t检验；若不符合正态分布，则采用Mann-Whitney U 非参数检验或配对非参数检验。计数资料以频数或构成比表示，用卡方检验进行分析。按照ΔΔCt =(Ct目的基因- Ct内参基因)试验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组计算外周血中lncR CTB-114C7.4、miR-3656 及BCL2A1 的2-ΔΔCt值 及 差 异 倍 数（fold change，FC），以分析网络表达水平。所有数据均采用双侧检验，P≤0.05表示有统计学差异。

2 研究结果

2.1 基线情况

试验组和对照组在性别（P= 0.098）、年龄（P=0.992）、吸烟（P= 0.065）、饮酒（P= 0.108）、体重指数（P= 0.549）、合并危险因素（P= 0.072）、用药情况（P=0.257）和血运重建情况（P=0.816）等方面均无统计学差异，表明两组具有可比性。

2.2 心绞痛疗效

分别统计试验组和对照组的心绞痛发作频率（表1），比较治疗前后的组间差异。结果显示，两组治疗前的频数分布无统计学差异（P=0.911），表明两组治疗前的心绞痛发作水平一致。经XST 治疗4 周后，试验组的心绞痛发作次数明显减少，与对照组相比有统计学差异（P＜0.001）（表1）。

表1 两组患者心绞痛发作频率表

2.3 硝酸甘油停减率疗效

分别统计试验组和对照组的硝酸甘油使用频率（表2），比较治疗前后的组间差异。结果显示，两组治疗前的频率分布无统计学差异（P=0.070），表明两组治疗前的硝酸甘油使用情况一致。经XST 治疗4 周后，试验组的硝酸甘油使用量显著降低，与对照组相比有统计学差异（P＜0.001）。

表2 两组患者硝酸甘油使用频率表

2.4 中医证候疗效

采用《冠心病心绞痛血瘀证疗效评价标准》[6]评价试验组和对照组的血瘀证积分变化，比较治疗前后两组的变化值情况（表3）。根据该标准积分规则，分值越大表明血瘀证程度越重。同时，按照“减分率=100%”公式，计算两组的尼莫地平减分率。根据减分率百分比“≥70%、≥30%、＜30%”，将疗效分成3个等级，即“显效、有效、无效”。

表3 两组患者血瘀证积分值（Mean±SD）

结果显示，治疗前两组的血瘀证积分无统计学差异（P=0.518），表明二者的血瘀证轻重程度一致。经XST 治疗4 周后，试验组的血瘀证积分明显降低，与对照组相比有统计学意义（P＜0.001）。减分率统计分析显示，试验组的平均减分率为34.44%，对照组则为6.63%。根据减分率百分比将临床疗效分为3组，试验组显效和有效共27 人（显效2%，有效65%），无效13人（占33%）；对照组无效30 人（占79%），有效8 人（占21%），两组的疗效分布有统计学意义（P＜0.001）。

2.5 单项中医症状体征疗效

分别统计试验组和对照组的胸痛、胸闷、心悸、唇龈暗红、舌紫暗及脉涩的临床表现。根据《冠心病心绞痛血瘀证疗效评价标准》对单项中医症状体征的赋分规则，分别赋予不同的分值。去除治疗前和治疗后单项分值均为0 的病例，统计剩余患者各症状体征的变化值，当治疗后分值较治疗前下降时视为临床治疗有效。结果显示，试验组的胸痛治疗有效率为80.65%，明显优于对照组29.73%，两者有统计学差异（P＜0.001）；试验组的胸闷治疗有效率为76.32%，优于对照组41.18%，两者有统计学差异（P= 0.002）；试验组的唇龈暗红治疗有效率为32.26%，明显优于对照组8.82%，两者有统计学差异（P=0.018）。同时，试验组有缓解心悸、舌紫暗和脉涩的趋势，但与对照组相比无统计学差异。

2.6 安全性分析

分别统计试验组和对照组的血常规、肝肾功能、血糖血脂及凝血功能等安全性指标，以评价药物的临床安全性。其中，血常规包括白细胞（white blood cell，WBC）、红细胞（red blood cell，RBC）及血小板（platelet，PLT）；肾功能包括肌酐（creatinine，Cr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）；肝功能包括谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和 谷 丙 转 氨 酶（alanine aminotransferase，ALT）；凝血功能包括活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）和纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）；血脂包括总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白（low density Lipoprotein，LDL）。试验组治疗后比治疗前的血糖、LDL、AST 和ALT 含量下降，有统计学差异（P=0.019、P= 0.014、P= 0.006、P= 0.005），血常规、肾功能及凝血功能等指标在治疗前后均无变化；对照组的各项指标在治疗前后亦均无变化（表4）。该结果表明，XST具有调节血糖血脂水平和保护肝功能的作用，临床运用安全。

2.7 外周血有核细胞lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1调控网络的表达水平

根据血瘀证疗效统计结果，选取试验组中血瘀证治疗有效的全部病例，经外周血有核细胞总RNA 浓度和纯度检测后确定20例为试验组最终检测样品；同时，将对照组中所有无效病例按照尼莫地平减分率升序排列，选择百分比最小的前20位作为对照组病例。运用qRT-PCR 检测两组治疗前后的lncR CTB-114C7.4、miR-3656及BCL2A1表达水平（图1）。

表4 两组患者安全性指标统计表（Mean± SD）

图1 调控网络中各RNA的表达水平

以上结果表明，试验组治疗后比治疗前的lncR CTB-114C7.4表达上调（FC=7.4），但差异无统计学意义（P= 0.526）；miR-3656 表达下调（FC= -2.4），差异有统计学意义（P＜0.001）；BCL2A1 表达显著上调（FC=57.1），差异有统计学意义（P=0.025）。而对照组治疗后比治疗前的lncR CTB-114C7.4和BCL2A1表达水平均无统计学差异（P= 0.332、P= 0.765），但对miR-3656 表达具有下调作用（FC= -1.3），差异有统计学意义（P=0.040）。

进一步组间比较发现，治疗前试验组与对照组的lncR CTB-114C7.4、miR-3656 及BCL2A1 表达水平均无统计学差异，表明两组基因表达基线一致。治疗后与对照组相比（表5），试验组的lncR CTB-114C7.4 表达显著上调（FC=35.1），差异有统计学意义（P=0.046）；miR-3656 表达下调（FC= -1.9），差异有统计学意义（P＜0.001）；BCL2A1 表达上调（FC= 9.0），差异有统计学意义（P=0.049）。

表5 治疗后两组调控网络的相对差异表达水平

本研究表明XST 减少心绞痛发作、提高硝酸甘油停减率及改善中医证候和单项症状体征的临床疗效存在微观物质基础。其潜在的作用机制为激活lncR CTB114C7.4 ↑-miR3656 ↓-BCL2A1 ↑调 控 网 络。XST 上调lncR CTB114C7.4 表达后，lncR CTB114C7.4通过其miRNA 识别元件与miR-3656 结合，降低了游离miR-3656 表达水平，竞争性抑制了游离miR-3656与靶基因BCL2A1的结合，从而导致游离BCL2A1含量增多，而BCL2A1 作为编码mRNA，能翻译成BCL2A1蛋白质，进而表现出相应的功能。因此，XST介导的该调控网络将最终由BCL2A1 发挥出相应的生物学功能，而lncR CTB114C7.4 和miR-3656 虽然不能直接翻译蛋白，却是激活该网络的关键上游调控因子和中间环节。为了进一步验证以上调控模式，并揭示该网络介导的下游细胞学功能，我们后续开展了基于RNA 干扰技术的lncR CTB-114C7.4 和miR-3656 敲降及过表达的细胞实验，这将为明确XST 的lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1↑网络作用机制提供更多的证据支撑，研究结果值得我们期待。

3 研究结论

通过临床随机双盲安慰剂对照试验，本研究获得如下结论：①XST 治疗冠心病不稳定型心绞痛血瘀证患者，不仅能减少心绞痛发作次数，提高硝酸甘油停减率；还能降低患者的血瘀证积分，将平均减分率从6.63%提高到34.44%，并改善胸痛、胸闷和唇龈暗红的单项中医症状体征。②XST 对患者血常规、肾功能及凝血功能等无影响，并能改善血糖血脂和肝功能指标，表明其临床运用安全。③XST 在临床运用有效和安全的前提下，能进一步上调患者外周血中lncR CTB-114C7.4 和BCL2A1 表达，并下调miR-3656 表达水平，从而发挥调节lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1↑网络的作用。

4 讨论与展望

lncRNA、miRNA 均为非编码RNA，能调节下游mRNA 表达量，进而影响靶基因翻译[7-10]，发挥相应的生物学功能。lncRNA 又属于竞争性内源RNA[11]，含有miRNA识别元件，能与mRNA竞争相同的miRNA结合位点，从而抑制miRNA 与mRNA 的结合，影响miRNA对靶基因的调节作用。因此，lncRNA、miRNA、mRNA三者之间往往能形成lncRNA-miRNA-mRNA 网络，参与体内的生理病理过程，是药物干预的潜在作用靶点及调控机制。目前，已有研究[4，5,12]报道lncRNAmiRNA-mRNA 调控网络参与了冠心病血瘀证的发生机制，而lncR CTB-114C7.4 和miR-3656 作为上游非编码RNA，能调节多种mRNA，进而影响细胞凋亡。BCL2A1 是BCL2 家族的主要基因之一，具有抗细胞凋亡的作用[13，14]，能保护心肌缺血再灌注损伤[15]。因此，本研究从lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1 网络层面研究XST 的作用机制。相比早期单一靶点及机制的研究结果[16-18]，该研究有利于揭示中药多靶点、多层次、整体调节的作用优势，从而促进中医药治疗冠心病临床疗效的提高。