高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1含量的不确定度评定

陈 梦，邹小龙，范 蕾，姜 川，陈卫平，卢光英，饶 琛，章小洪

(丽水市食品药品与质量技术检验检测院，浙江 丽水 323000)

黄曲霉毒素M1(AFM1)是黄曲霉毒素B1的羟化衍生物，具有剧毒性和强致癌性，早在1993年就被世界卫生组织列入Ⅰ类致癌物质.我国规定乳及其乳制品中黄曲霉毒素的限量为0.5 μg/kg，而欧盟的限量标准更为严苛(0.05 μg/kg)，因此准确测定乳及其乳制品中AFM1的含量，具有十分重要的意义[1-3].

现阶段关于牛奶中黄曲霉毒素M1不确定度的研究报道较少.不确定度是评价测量结果准确性的重要依据，完整的检测结果应包含测量估计值及测量不确定度.GB/T 27025-2008《检验和校准实验室能力的通用要求》[4]中规定：检测实验室应具有并应用评定测定不确定度的程序，作为一个检测结果，当不确定度影响到检测结果对规范限度的符合性时，检测报告中还应包含有关不确定度的信息.本文参考CNAS-GL006-2019《化学分析中不确定度的评估指南》[5]和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[6]，对GB 5009.24-2016[7]高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1含量的不确定度来源进行分析和评定，计算测量不确定度，为实验室测量结果的准确性和可靠性提供技术依据.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；KQ-250DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ST16高速离心机(美国Thermo Fisher公司)；AUTO EVA全自动浓缩仪(厦门睿科公司)；MS3 basic涡旋混合器(德国IKA公司);XPE105电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；超纯水发生器(美国Think-lab公司).

黄曲霉毒素M1标准品(0.5 μg/mL，BePure公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，Merck公司)；0.22 μm有机相滤膜(天津津腾公司)；黄曲霉毒素M族免疫亲和柱(BEACON公司).

1.2 样品前处理

称取混合均匀牛奶试样4 g(精确至0.1 mg)于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋3 min，4 ℃下6 000 r/min离心10 min，移出上层清液，加入40 mL水稀释，待净化.

低温保存的免疫亲和柱恢复至室温后，将柱内液体放出，弃去，将待净化液转移上柱，调节流速为2 mL/min，样液滴完后，继续加入10 mL水淋洗柱子，待水滴完后，减压抽干.加入5 mL乙腈进行洗脱，收集洗脱液，40 ℃氮吹至干，用1.0 mL初始流动相溶解，0.22 μm有机相滤膜过滤，供高效液相色谱仪测定.

1.3 标准溶液的配制

准确移取0.50 mL标准品于5 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，作为标准储备液.准确吸取1.0 mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用初始流动相定容，得到标准中间液5.0 ng/mL，分别移取1.0、2.0 mL标准中间液于5 mL容量瓶，1.0 mL标准中间液于10 mL容量瓶，用初始流动相定容，得到1.0、2.0、0.5 ng/mL标准溶液，准确移取1 mL标准溶液(2.0 ng/mL)于10 mL容量瓶中，用初始流动相定容，得到0.2 ng/mL标准溶液.标准曲线系列质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL.

1.4 仪器条件

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：50 μL；检测器：荧光检测器(激发波长：360 nm，发射波长：430 nm)；流动相：水∶甲醇∶乙腈(体积比为70∶15∶15).

1.5 不确定度数学模型建立

牛奶中黄曲霉毒素M1含量计算公式[7]：

(1)

其中，X：供试品中AFM1的质量分数，μg/kg；m：样品质量，g；As：对照品溶液中AFM1的峰面积；A：试样溶液中AFM1的峰面积；V：样品溶液的稀释倍数，mL；Cs：对照品溶液中AFM1的质量浓度，ng/mL.

2 不确定度来源分析及评定

2.1 不确定度来源分析

通过对试验方法和数学模型分析可知，不确定度来源主要有：Urel(1)标准工作溶液引入的不确定度，Urel(2)校准曲线拟合引入的不确定度，Urel(3)样品质量和定容体积引入的不确定度，Urel(4)试验回收率引入的不确定度，Urel(5)测试重复性引入的不确定度.

方差合成：

(2)

2.2 不确定度分量的评定

2.2.1 标准工作溶液引入的不确定度

(1)标准物质引入的不确定度：根据标准物质证书，AFM1标准品纯度为0.5 μg/mL，不确定度为±3%(k=2)，相对标准不确定度为：

U(1.1)=3%/2=0.015

(3)

(4)

玻璃量具的校准温度为20 ℃，而实验室的温度变化在20±3 ℃之间，液体的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，温度变化引入的不确定度可以通过液体的体积膨胀系数来计算，乙腈的膨胀系数为1.37×10-3，按矩形分布，受温度影响的标准不确定度为：

(5)

则移取0.5 mL相对标准不确定度为：

(6)

(7)

温度影响的标准不确定度为：

(8)

5 mL容量瓶的相对标准不确定度为：

(9)

(10)

因此由标准工作液引入的不确定度为：

=0.018 2

(11)

表1 标准曲线溶液配制引入的不确定度

2.2.2 标准曲线拟合引入的不确定度

标准曲线采用最小二乘法对标准曲线进行拟合，标准曲线溶液浓度及峰面积如表2所列，得到线性回归方程：y=313.7x+23.0，相关系数r为0.998，标准溶液峰面积的残差标准偏差：

(12)

样品测定次数p为6，标准工作曲线拟合引入的不确定度为：

(13)

2.2.3 样品称量和定容体积引入的不确定度

(14)

称样量为4 g，样品称量的相对标准不确定度为：

U(2.2)=U(2.1)/4=5.77×10-5/4=1.44×10-5

(15)

(16)

表2 标准曲线溶液拟合引入的不确定度

水的膨胀系数为2.1×10-4，实验室温度在20±3 ℃之间，受温度影响的标准不确定度为：

(17)

样品定容的相对标准不确定度为：

(18)

相对合成不确定度为：

(19)

2.2.4 回收率引入的不确定度

在4 g空白牛奶样品中添加1 ng AFM1标准品，按样品前处理步骤平行加标6份，测得回收率结果如表3所列，对回收率进行显著性检验分析，

(20)

当自由度f为4时，查t临界值分布表，t(0.05,4)=2.776，t>t(0.05,4)，回收率与100 %具有显著性，因此，应考虑平均回收率引入的不确定度.

表3 样品回收率

标准偏差为：

(21)

相对标准不确定度为：

(22)

2.2.5 测试重复性引入的不确定度

在4 g空白牛奶样品中添加1 ng AFM1标准品，按样品前处理步骤进行平行处理6份，进行测定，结果如表4所列.

标准偏差为：

(23)

表4 样品重复测定结果

相对标准不确定度为：

(24)

2.3 合成标准不确定度评定

上述各相对不确定度合成牛奶中AFM1含量测定结果的相对标准不确定度为：

(25)

取包含因子k=2，AFM1扩展不确定度为：0.048 4 μg/kg，测定结果表示为：X=0.842±0.048 4 μg/kg，k=2.

3 结论

本文采用GB 5009.24-2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》测定牛奶中黄曲霉毒素M1含量，通过对各分量不确定度的分析，其扩展不确定度为X=0.842±0.048 4 μg/kg，k=2，该方法的不确定度主要来源于标准品纯度和样品回收率.因此，在实际检测工作中，可以通过选择纯度更高的标准物质来减小标准品纯度引入的不确定度，优化前处理方法和改善操作规范可以提升样品的回收率，从而减小结果的不确定度，提高检测结果的准确性.