百会及印堂穴对七氟醚麻醉后大鼠认知功能的影响及机制探究

2020-04-19詹飞燕魏教华吴仁庆

世界中医药 2020年5期

詹飞燕魏教华吴仁庆

摘要目的：觀察电针百会穴、印堂穴对七氟醚麻醉后大鼠认知功能的影响，同时检测脑组Sonic Hedgehog（Shh）通路标志性蛋白水平的变化。方法：纳入30只SPF级SD大鼠，随机分为空白组、麻醉组及电针组，每组10只。空白组大仅进行模拟捉拿，麻醉组大鼠吸入3.0%七氟醚30 min，随后用1.5%七氟醚麻醉维持3 h，电针组在此基础上进行电针干预，连续干预7 d。干预结束后用Morris水迷宫检测各组学习记忆能力变化，HE染色法观察各组海马组织的结构变化，Western blot及Real-Time PCR法检测各组海马组织Shh、Gli、PI3K、pAKT蛋白及mRNA的水平变化。结果：1）Morris水迷宫显示：麻醉组及电针组大鼠游泳总路程及逃避潜伏期明显较空白组延长（P<0.05），其中电针组较麻醉组明显改善（P<0.05）。2）HE染色提示空白组大鼠海马组织结构形态正常，麻醉组及电针组大鼠海马组织均出现明显结构破坏，细胞排列错乱，神经元细胞出现明显变形缩小，其中电针组海马形态结构较麻醉组改善。3）Western blot及PT-PCR的结果显示，麻醉组及电针组大鼠海马组织Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表达较空白组降低（P<0.05），其中电针组较麻醉组改善（P<0.05）。结论：七氟醚可对认知能力产生一定损害效应，电针百会穴、印堂穴可明显提升认知能力，其作用机制可能与激活Shh通路通路有关。

关键词七氟醚;学习记忆能力;百会穴;印堂穴;海马;Shh通路

Study on Effects of Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）on Cognitive Function of Rats After Sevoflurane Anesthesia and Its Mechanism

ZHAN Feiyan，WEI Jiaohua，WU Renqing

（Department of Anesthesiology，United Logistics Support Force 908 Hospital，Nanchang 330000，China）

Abstract Objective：To observe effects of electroacupuncture at Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）on cognitive function after sevoflurane anesthesia in rats，and to detect level changes of Shh pathway marker protein in brain tissue.Methods：Thirty SPF SD rats were included in this study and randomly divided into blank group（n=10），anesthesia group（n=10）and electroacupuncture group（n=10）.The rats in the blank group were only subjected to simulated capture.The rats in the anesthesia group inhaled 3.0% sevoflurane for 30 min，then they were anesthetized with 1.5% sevoflurane for 3 h.On this basis，the electroacupuncture group was treated with electroacupuncture for 7 d.After the intervention，Morris water maze was used to detect changes of learning and memory ability in each group.HE staining was used to observe structural changes of hippocampal tissue in each group.Western blot and Real-Time PCR were used to detect level changes of Shh，Gli，PI3K，pAKT protein and mRNA in hippocampal tissue in each group.Results：The Morris water maze showed that total swimming distance and escape latency in the anesthesia group and electroacupuncture group were significantly longer than those in the blank group（P<0.05），and those in the electroacupuncture group were significantly improved compared with those in the anesthesia group（P<0.05）.2）HE staining showed that the morphology of hippocampal tissue was normal in the blank group，and the hippocampal tissue in the anesthesia group and electroacupuncture group showed obvious structural destruction，disordered arrangement of cells and obvious deformation and reduction of neuron cells.The morphological structure of hippocampus in the electroacupuncture group was better than that in the anesthesia group.3）Western blot and PT-PCR showed that the expressions of Shh，Gli，PI3K，p-AKT protein and mRNA in hippocampus of rats in the anesthesia group and electroacupuncture group were lower than those in the blank group（P<0.05），and those in electroacupuncture group were better than those in the anesthesia group（P<0.05）.Conclusion：Sevoflurane can have a certain damage effect on cognitive ability.Electroacupuncture at Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）can obviously improve cognitive ability，and its mechanism may be related to activation of Shh pathway.

Keywords Sevoflurane; Learning and memory ability; Baihui（GV 20）; Yintang（EX-HN3）; Hippocampus; Shh pathway

中图分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.013

术后认知障碍（Postoperative Cognitive Dysfunction，POCD）指的是患者手术麻醉前无认知功能障碍，术后出现注意力、记忆力、定向力等认知功能减退表现的中枢神经系统并发症[1-2]。有数据显示，POCD的老年患者发生阿尔兹海默病的风险明显高于认知功能正常的老年人群[3-5]，因此降低POCD发生率具有重要的临床意义。学者认为多途径综合作用导致POCD的发生，随着研究的不断深入POCD的发病机制逐渐倾向于麻醉剂促使中枢神经炎性反应激活，对中枢神经产生一定的神经毒性而出现认知受损。Sonic Hedgehog（Shh）信号通路在海马神经发生发育中占据重要位置，近年来有研究[6-7]显示成年大鼠受到炎性刺激后脑组织Shh被激活，更有研究人员[8]认为脑组织Shh信号激活具有炎性反应依赖性。

针灸是中医学的重要组分，大量资料显示刺激特定穴位可明显改善认知功能。百会穴位于机体巅顶，是三阳五会之穴;印堂穴位于额叶，解剖学显示印堂穴所在皮下分布大量的末梢神经。本团队在前期研究证实刺激百会穴、印堂穴对POCD疗效确切，但其作用机制不清，故本研究利用动物模型进一步探析百会穴、印堂穴治疗POCD的作用机制，具体如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 30只SPF级SD大鼠，均购自长沙市天勤生物有限公司;许可证号为scxk（湘）2014-0010，scxk（湘）2014-0011。体质量550～600 g，平均体质量（575±5.84）g，鼠龄16～18个月，平均鼠龄（17±0.35）个月。

1.1.2 仪器与试剂 Morris水迷宫（江苏赛昂斯公司）;Shh一抗抗体（Abcam公司，ab19897）、Gli一抗抗体（Abcam公司，ab151796）、PI3K一抗抗体（Abcam公司，ab129182）、p-AKT一抗抗体（Abcam公司，ab129402）;Model68酶标仪（美国Bio-Rad Laboratories）;七氟醚（山东鲁南贝特制药有限公司，批号：65170507）;Vamos气体检测仪（德国Draeger公司）;针具（华佗牌0.3 mm×25 mm）;SDS配胶试剂盒（碧云天生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

1.2.1.1 分组将30只大鼠按照随机数字法分为空白组、麻醉组及电针组，每组10只。3组大鼠在鼠龄、体质量、饲养环境等方面差异无统計学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2.1.2 POCD模型制备

1）空白组处理方法：仅将空白组大鼠置于麻醉箱内，持续吸入纯氧3 h，随后返回饲养笼内，安静情况下饲养，自由饮水摄食。

2）麻醉组及电针组处理方法：依据参考文献[9]中的方法建立POCD模型，将麻醉组及电针组大鼠置于钢化麻醉箱（70 cm×50 cm×40 cm）中，麻醉箱设置2个端口，一个端口接入麻醉机，另一个端口接入氧气管，随后麻醉机释放七氟醚，同时使用Vamos气体检测仪对麻醉箱内七氟醚浓度进行检测，使其保持浓度3.0%，持续吸入30 min，随后用1.5%七氟醚麻醉及2 L/min氧气流量维持3 h。随后吸入纯氧10 min，待大鼠清醒后返回饲养笼内，安静情况下饲养。

1.2.2 干预方法电针组大鼠针刺百会穴、印堂穴，取穴位置参照参照李忠仁主编[10]的《实验针灸学》，针刺深度为3 mm，每10 min行针1次，留针30 min，1次/d，连续治疗14 d。空白组和麻醉组均未治疗，针刺干预者对动物分组不知情。

1.2.3 观察指标与方法

1.2.3.1 行为学检测

1）Morris水迷宫测试：将水迷宫设置为4个象限，分别是第一象限、第二象限、第三象限及第四象限。将平台放在西南象限（第三象限）正中距池壁22 cm处，迷宫中清水平面高于安全平台1 cm，水温（22±0.5）℃，室温25 ℃，训练期间保持环境安静，迷宫外参照物不变，并在计算机软件中标记平台位置，随后将大鼠分别从一、二、三、四个象限的顺序放入水中，记录大鼠寻找到平台的时间，设置为逃避潜伏期，同时记录大鼠寻找到平台的总路程。造模前对所有大鼠进行适应性训练2 d，4次/d。

2）定位航行实验：测量大鼠对学习记忆的获取能力。实验历时5 d，受试动物每天分别从东北、西北2个象限入水点依次进行训练，将大鼠面向池壁放入水中，记录其逃避潜伏期（从入水至找到安全平台的时间），测试时间限定为60 s，超过者以60 s计。

3）空间探索实验：完成定位航行实验步骤后将平台撤离，从4个象限中挑选任意一象限作为固定入水点，大鼠面向池壁放入池中，记录大鼠在60 s内穿越原先平台位置的次数。

1.2.3.2 HE染色观察海马病理结构改变干预结束后从各组随机选取3只大鼠，充分麻醉后灌流4%多聚甲醛溶液，随后快速取出脑组织后分离出海马，并随机置于4%多聚甲醛溶液中。将标本置于包埋盒中，用流水充分去除固定液，持续30 min。用100%乙醇10 min→95%乙醇，5 min→80%乙醇5 min进行脱水后将样本置于二甲苯中透明，将已透明的样本置于已溶化的石蜡中进行包埋，将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片5 μm薄片，捞片至载玻片后放置于45 ℃恒温箱中烘干。染色前将石蜡切片脱蜡至水，用苏木素染色5 min后流动水冲洗1 min，再用1%盐酸乙醇分化1 min，再用流动水冲洗15 min后进行反蓝30 min，继续用流动水冲洗15 min后将样本玻片置于0.5%伊红水溶液中复染2 min，在进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封片，随后将玻片置于光学显微镜下观察并拍照。

1.2.3.3 Western blotting检测海马组织Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白表达水平的变化从各组中随机抓取3只大鼠，充分麻醉后取出海马组织，切割成约100 mg，加入1 mLRAPI裂解液，室温条件下静置30 min，4 ℃、15 000 r/min条件下离心5 min，取上清备用。取出25 μL进行BCA法测定样本蛋白浓度，根据样本上样缓冲液=4∶1的比例进行均匀混合后将每份待测置于100 ℃水浴锅中加热变性7 min，变性后迅速将样本放于冰上冷却，保存于-20 ℃冰箱备用。随后根据计算得出的上样量加样至先前配制好的SDS-PAGE凝胶孔中，进行跑胶，将目的蛋白转膜只PVDF膜，再用封闭液对PVDF膜进行封闭，封闭后将PVDF膜置于TBS中漂洗3次，5 min/次，随后用一抗稀释液按照1∶500的比例稀释β-actin、Shh、Gli、PI3K、p-AKT，4 ℃孵育过夜后置于TBS中漂洗3次，5 min/次，然后加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG（二抗稀释液1∶2 000稀释）室温孵育1 h，再用TBS漂洗3次，5 min/次。结束后在PVDF膜上滴入ECL显影液显影、拍照，用计算机扫描图像，并由Bio-Rad Image软件（Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美国）分析处理。

1.2.3.4 Real-Time PCR法检测海马组织Shh、Gli、PI3K、p-AKTmRNA表达水平的变化从各组中随机抓取3只大鼠，充分麻醉后取出海马组织，切割成约100 mg，加入1 mLTrizol，冰上静置5 min后加入200 μL氯仿粉后充分混匀，冰上静置5 min后置于4 ℃，15 000 r/min条件下离心10 min，摒棄上清液，20 μL DEPC水，根据说明书进行逆转录成cDNA，逆转录过程如下：95 ℃（6 min）→55 ℃（90 s）→72 ℃ 90 s）→72 ℃（10 min）→5 ℃（1 h）。以GAPDH为内部参照，利用ABI7500软件得出（Ctcycle threshold）值，空白组△Ct值作为校正数值，软件根据2-△△Ct数值计算得出Shh、Gli、Ptch1mRNA浓度水平。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，3组数据同时符合正态分布和方差齐性则采用单因素方差分析，若其中一组数据不符合正态分布，则采用多组秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组行为学变化麻醉组及电针组大鼠游泳轨迹和逃避潜伏期较空白组延长（P<0.05），穿越平台次数减少（P<0.05），其中电针组明显较麻醉组改善（P<0.05）。见表1及图1。

2.2 3组HE染色结果比较 HE染色提示空白组大鼠海马组织结构形态正常，麻醉组及电针组大鼠海马组织均出现明显结构破坏，细胞排列错乱，神经元细胞出现明显变形缩小，其中电针组海马形态结构较麻醉组改善。见图2。

2.3 3组海马组织Shh、Gli达水平的变化 Western blot及PT-PCR的结果显示，麻醉组及电针组大鼠海马组织Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表达较空白组降低（P<0.05），其中电针组较麻醉组改善（P<0.05）。见图3及表2、表3。

3 讨论

POCD具有一过性，是手术麻醉后出现的轻度的神经功能紊乱综合征[11]，常发生于老年患者，主要以学习力、记忆力受损、执行力及注意力减弱为表现，其中学习记忆能力受损是POCD的核心症状，可在各年龄层患者发病。有研究人员[3]对1 064例不同年龄层的手术患者进行观察，在术后3个月随访时发现18～39岁年龄层有5.7%患者出现POCD，而60岁以上人群有12.7%出现POCD，且POCD的老年患者出现后3个月内的死亡率明显增加。由此对POCD进行积极预防与治疗具有重要临床意义。

临床实践证实刺激特定的穴位在防治POCD方面有重要疗效，有团队[12]以“健忘””呆病”“遗忘”“不识人”“恍惚”“忘前失後”“善忘”“怔忡”为术语对学习记忆障碍古籍进行梳理，结果显示百会穴是使用频次最高的穴位（31次），印堂穴（10次）。《黄帝内经》曰：“阳气者，精则养神，柔则养筋”，认知为神，形以衡为代表，督脉乃阳脉之海，百会穴别名“三阳五会”，《针灸甲乙经》云：“百会为督脉，足太阳之会”，《类经图翼》描述：“百会为督脉，足太阳、手足少阳和足厥阴之会”，以上均揭示百会穴是治疗神志疾病的要穴。印堂穴亦为督脉的要穴，有醒脑开窍、安神活络的作用。《难经·二十八难》云：“督脉者，起于下极之输，并于脊里，上至风府，入属于脑”[13-16]。由此可见，刺激督脉可养神充髓。本研究利用七氟醚制备POCD模型，用水迷宫检测大鼠学习记忆能力，结果显示POCD大鼠学习记忆能力明显较正常大鼠明显减退，且在研究中用HE染色发现POCD大鼠海马区出现明显结构破坏，细胞排列错乱，神经元细胞出现明显变形缩小，提示POCD与海马结构受损关系密切。同时，刺激百会穴、印堂穴后大鼠的学习记忆能力明显改善，且海马的病理结构出现一定程度的修复，提示百会穴、印堂穴改善POCD模型鼠学习记忆能力与修复海马病理结构有关。

Sonic Hedgehog（Shh）信号通路与神经系统疾病关系密切，近年来该通路与神经细胞炎性反应的关系备受关注[17]。Patched（ptc）和Smoothed（Smo）2种受体共同调控Shh通路的信号传递，Ptc受体与配体结合后对Shh信号通路产生负调控效应，而Smo对Shh通路的调控需在无Ptch的条件下进行，Smo被激活后介导Shh通路下游的核转录因子Gli的活性，从而活化PI3K/AKt信号通路，从而减轻炎性反应[18-20]。利用Western blot及Real-Time PCR显示POCD海马组织Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表达均明显下降，提示Shh信号通路参与了POCD的发生发展过程，而百会穴、印堂穴改善POCD模型鼠学习记忆能力可能是通过激活Shh通路实现的。

由此可以认为，七氟醚可对大鼠造成一过性认知障碍，百会穴、印堂穴改善POCD模型鼠学习记忆能力的作用机制可能与激活Shh信号通路有关。

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