赤芝全基因组SSR位点的筛选及种质资源遗传多样性分析

徐晓兰 陈体强 兰进 陈向东 朱风丽 陈虎 石林春 陈士林

摘要 目的：基于赤芝全基因組序列开发SSR标记，研究其种质资源遗传多样性，为赤芝种质资源品种鉴定和分子育种提供理论基础。方法：利用60对SSR引物，对26份不同来源的赤芝菌株进行扩增以筛选出具有多态性的位点;采用毛细管电泳对其进行基因分型，并分析菌株间的遗传多样性。结果：60对引物中，筛选出24个有多态性条带的SSR位点。共扩增出269个多态性条带，平均每个SSR位点增出11.20个多态性条带;检测出150个等位基因，平均检测出6.23种基因型;各引物的多态信息含量（PIC）为0.57～0.91，平均为0.81;遗传一致性和遗传距离变异范围分别为0.28～0.95和0.06～0.73;聚类分析结果分析可以很好的反映出各个菌株间的亲缘关系，在遗传距离系数0.17处可分为4大类，部分来自同一地区的菌株材料分散于各个分支，未体现明显地域性，说明菌株的遗传背景复杂，多态性高。结论：筛选出的24个赤芝SSR位点，可以用于赤芝菌株资源遗传多样性分析，为赤芝优良品种的引种及选育提供理论基础。

关键词 赤芝;基因组;SSR标记;多态性;种质资源;遗传多样性;聚类分析;育种

SSR Loci Selection Based on Ganoderma lucidum Genome and Genetic Diversity Analysis

XU Xiaolan1， CHEN Tiqiang2， LAN Jin3， CHEN XiangDong3， ZHU Fengli1， CHEN Hu1， SHI LinChun3， CHEN Shilin4

（ 1 College of Bee Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2 Institute of Edible and Medicinal Fungi， Fujian Academy of Agriculture Science， Fuzhou 350014， China; 3 Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College， Beijing 100193， China; 4 Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract Objective：To study genetic diversity of its germplasm resources and to provide theoretical bases for the resource variety identification and molecular breeding of G.lucidum.based on SSR markers of the whole genome of Ganoderma lucidum.Methods：A total of 26 G.lucidum strains from different regions were amplified to screen out polymorphic sites using 60 pairs of SSR primers.The genotyping was carried out by capillary electrophoresis and the genetic diversity among the strains was analyzed.Results：Among 60 primer pairs， 24 SSR loci with polymorphic bands were selected.A total of 269 polymorphic bands were amplified， with an average of 11.20 polymorphic bands per SSR locus; a total of 150 alleles （Ne） were detected with an average of 6.23 type of gens.The polymorphism information content （PIC） of the primers were ranged from 0.57 to 0.91， and the average was 0.81.Genetic identity and genetic distance variation range were 0.28-0.95 and 0.06-0.73， respectively.The results of cluster analysis can well reflect the genetic relationship between various strains and can be divided into 4 subgroups with genetic distance coefficient of 0.17.The strains materials from the same region were scattered in various branches， which did not show obvious regional characteristics， indicating that the genetic background of G.lucidum strains was complex and highly polymorphic.Conclusion：The 24 selected SSR loci can be used to analyze the genetic diversity of the G.lucidum strains， which provide the theoretical basis for the introduction and breeding of the best varieties of G.lucidum.

Keywords Ganoderma lucidum; Genome; SSR maker; Polymorphism; Germplasm resources; Genetic diversity; Clustering analysis; Breeding

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.004

赤芝（Ganoderma lucidum）是我国著名的药用真菌之一，具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、保肝解毒、抗放射、抗病毒和抑菌等作用[1-3]。我国赤芝种质资源相当丰富，民间用于栽培和工业发酵的菌株相当多。中国从事灵芝研究的高校、各级科研院所及公司企业超上百家，各自拥有一定数量的灵芝种质资源，据不完全统计现有数百种。近年来，四川、山东、广西、安徽、福建和江西等地都在不断地扩大赤芝栽培规模。栽培规模的逐渐扩大，使得地区之间相互引种，而导致菌种的名称混杂。目前灵芝菌种的命名多由各菌种保藏中心、科研院所或者是菌种供应企业提供，缺乏统一的规范，在引种过程中还会发生被更换的现象，使得菌种间的亲缘关系难以确定，因此菌种市场较为混乱，影响了灵芝产业的健康发展。

除了传统的形态鉴定法和拮抗法，分子标记技术的发展也为赤芝菌株的分类和遗传多样性分析提供了新的技术和方法，包括RAPD[4-5]、ISSR[6-7]、SRAP[8-9]等。近年来，由于SSR标记具有多态性高、具有多等位基因，且操作简单、重复性好等优点，因此广泛的被用于农作物的品种鉴定、种质资源亲缘关系和遗传多样性的分析中[10-12]。2012年，中国医学科学院药用植物研究所陈士林课题组完成了赤芝G260125-1全基因组的测序工作。赤芝全基因组的阐释为灵芝功能基因的研究提供了基础，也为SSR的挖掘提供了数据[13-14]。在赤芝中，总共发现了2 674个SSR位点，其中单碱基重复最为丰富[15]。尽管前期研究已对灵芝SSR位点相关信息进行了分析，但关于SSR在灵芝各功能基因中的标记以及SSR引物还未被开发。

本研究选用了来自不同地区的26个赤芝菌株作为实验材料，根据赤芝全基因组序列筛选SSR引物，开展遗传多样性研究，为促进赤芝种质资源保护和品种选育奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株材料

用于本研究的26个赤芝菌株来自北京、山东、浙江、四川、安徽、湖北、江西和福建等地，详细情况见表1。

1.2 赤芝DNA提取

赤芝菌株保存在斜面试管，转接平面培养基上，28 ℃活化后转接至PDA液体培养基中，28 ℃培养5～7 d，收集菌絲。使用DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，中国，批号：Lot#S7412）提取基因组总DNA。

1.3 SSR-PCR反应

根据课题组前期基于赤芝全基因组序列的SSR分析结果，设计60对引物，筛选出具有多态性的24对引物。见表2。

SSR-PCR反应体系为25 μL：模板总DNA为20～50 ng，正向引物为1 μL（浓度10 μmol/L），反向引物1.0 μL（浓度10 μmol/L），2×EasyTaq SuperMix 12.5 μL（北京全式金生物，中国，批号：Lot#20316），剩余用ddH2O补齐。PCR反应程序如下：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s、55 ℃～65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，10个循环;94 ℃变性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35个循环;最后72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物送至上海生工生物技术公司进行微卫星分析。

1.4 数据分析

利用GeneMapper软件分析原始数据，得到扩增产物的长度。利用Microsatellite Toolkit软件计算各位点的多态信息含量（PIC）。利用Popgene32 V1.32软件计算等位基因数（Na）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Shannon信息指数（I）、Nei′s遗传距离和遗传一致性。根据Nei′s遗传距离，利用Mega 6.0软件UPGMA法对不同灵芝菌株间的遗传关系进行聚类分析。

2 结果

2.1 赤芝SSR标记多态性分析

本研究共筛选得到具有多态性的24对引物，对26份赤芝基因组DNA进行扩增，检测得到269个SSR条带。见表3。每对引物5～19条，其中引物1和19扩增的条带最多为19条，引物18扩增的条带最少为5条，平均条带数为11.20。22对引物PIC（多态性信息量）的变化范围是0.57～0.91，平均值为0.81。其中，PIC最高的是11号引物，最低的是18号引物。

扩增得到24个位点的有效等位基因数（Ne）为2.32～10.32，18号引物最少，11号引物最多，平均6.26个。各引物的观测杂合度（Ho）为0.15～0.96，23号最低，22号最高，平均为0.50。各引物的期望杂合度（He）为0.57～0.91，18号最低，11号最高，平均为0.81。Shannon多样性指数（I）为0.99～2.61，18号最低，11号最高，平均为1.98。

2.2 26个赤芝菌株的遗传多样性分析

对26份赤芝菌株的遗传一致性和遗传距离进行分析，结果见表4。26份灵芝菌株间的遗传一致性变异范围为0.28～0.95，平均遗传一致性为0.58;遗传距离为0.06～0.73，平均遗传距离为0.42。其中，赤芝KG（X15）和灵2（X22）间遗传相似系数最小，遗传距离最大，说明二者亲缘关系较远;泰山灵芝（X10）和赤芝KG（X15）间遗传相似系数较大，遗传距离最小，说明二者亲缘关系较近。

2.3 26个赤芝菌株的聚类分析

通过UPGMA法利用遗传距离系数对26份赤芝菌株种质资源材料进行聚类分析，如图1所示。在遗传距离为0.17的阈值处，可将26份赤芝菌株分为4个类群，第1类群由古田赤芝、赤芝GL108、CGMCC5.67、赤芝G201、赤芝G10、赤芝G1、武夷灵芝、灵2、CGMCC5.0026、赤芝6号、赤芝Ga66等菌株组成，第2类群由美大灵芝、韩国灵芝（药植所）、CGMCC5.65等组成，第3类群由赤芝26、韩国灵芝（冠县）、赤芝G202、鹿角灵芝和多孢灵芝等组成，第4類群由泰山灵芝（武汉）、赤芝LQ2、中国灵芝、赤芝LQ1、泰山灵芝（冠县）、赤芝KG和CGMCC5.425等组成。由图1可知，除泰山灵芝和龙泉灵芝外，部分来自同一地区的菌株并未聚集在同一类群里。

4 讨论

灵芝在我国有2 000多年的栽培历史，现代灵芝产业发展迅速，所具价值也日益凸显。近年来，灵芝栽培技术及加工技术得到一定的发展，但存在种植技术落后，新品种少，产品质量参差不齐等问题[16]。而赤芝种质资源的研究与保护尚属起步阶段，高品质赤芝产品没有保障，阻碍了其市场品牌建设步伐。由于赤芝子实体形态会受到外界环境的影响，例如，通过调控栽培条件赤芝可由正常状态生成鹿角状;一些形态相近的古田灵芝、开平灵芝等会被用作赤芝使用[17]。灵芝栽培历史悠久，研究人员也在不断进行品种选育工作。传统的遗传育种实践中，一般是以产量、形态、有效成分等性状为指标，基于现有的种质资源，通过表型选择进行农艺性状的转移与改良。朱惠照等人通过对浙江的野生赤芝驯化，首先选育出“仙源5号”，又以其为出发菌株，进行选育得到了“仙芝1号”[18]。随后张蕾等人经过航天育种，在“仙芝1号”基础上得到“仙芝2号”[19]。刘新锐等人以“南韩灵芝”和“G8-2”为亲本，通过原生质体单核化杂交，筛选获得灵芝新品种“芝102”[20]。传统选育方法得到的赤芝菌种具有产量高、朵型好及产量高等优点，同时也存在着周期较长、遗传改良效率偏低等问题。此外，在赤芝选育过程中，经常使用菌丝的拮抗实验来验证菌株间的亲缘关系，效率较低且工作量较大。因此，采用有效的分子标记研究其遗传多样性，可为赤芝优良品种的引种与选育提供理论基础。

SSR标记作为可靠、高效且简单易操作的标记技术，用于植物遗传育种方面的研究主要包括构建分子遗传连锁图谱、基因定位和QTL分析、品种鉴定与指纹图谱构建、分子辅助选择育种及遗传多样性分析[21-22]。分子标记辅助选择育种将分子生物学与传统育种结合起来，分析与目标基因紧密连锁的分子标记，以获得目标性状的基因型，从而提高育种效率。例如，Gupta等利用代表谷子9条染色体的50个SSR标记对184个不同地方的谷子进行了基因分型。并利用基于遗传距离的聚类方法和基于一般模型的聚类方法对这些遗传多样性进行了研究。通过对群体结构和亲缘关系的关键信息关联分析，确定了8个与谷子9个农艺性状之间存在显著的关联的SSR标记，可有效地应用于谷子育种[23]。从全基因组序列中开发SSR引物，对收集的赤芝菌株进行遗传多样性评价，并进行聚类分析和指纹图谱分析，明确赤芝品种的遗传基础，建立品种的鉴定方法，为赤芝品种的亲本选配和遗传改良提供理论依据，是推动灵芝产业发展的重要问题之一。

SSR分子标记技术在赤芝菌株遗传多样性方面的研究较少。前期，张肖雅等人利用其他来源的8对SSR引物对11个灵芝菌株进行扩增，并用电泳法对其多态性条带进行分析，每对引物检测到的等位基因数量在2～6之间[24]。本文利用60对引物对赤芝26个菌株进行SSR分析，筛选出24对具有多态性的引物，每对引物检测到的等位基因数量在5～19之间。各引物的多态信息含量（PIC）为0.57～0.91，平均为0.81。数据表明，基于赤芝基因组开发的SSR位点能更好的体现菌株间的遗传多样性。

利用SSR标记分析26个赤芝菌株的遗传一致性系数，得到各菌株间遗传一致性系数平均值为0.58，变化范围为0.28～0.95，UPGMA聚类结果显示菌株分类与其来源地无明显相关性。刘雪莹等人利用ITS序列对中国8个不同地理群体的168份灵芝样本进行遗传多样性分析，显示野生赤芝不同地理群体间的遗传变异占4.33%，群体内的变异占95.67%，说明中国野生赤芝的遗传分化主要来自于群体内部[25]。本研究中，少部分来自同一地区的聚在一支上，如第一支中来自福建的古田赤芝和赤芝G201（遗传一致性为0.71），第三支中来自湖北武汉的鹿角灵芝和多孢灵芝（遗传一致性为0.93），第四支中来自龙泉的LQ1和LQ2（遗传一致性为0.85），这些菌株亲缘关系较近。此外，来自冠县和湖北的泰山灵芝遗传一致性系数高达0.94，说明2个菌株可能为同一菌种。但是，更多来自同一地区的赤芝菌株并未聚集在同一支，显示出丰富的遗传多样性，可能是由不同地区之间的相互引种、选育方式等原因造成。结果显示，本实验筛选的SSR标记可以清楚的反映各菌株间的亲缘关系。因此，在今后赤芝菌株的育种工作中，可选择亲缘关系较远的优良品种作为亲本，以促进赤芝优良品种选育工作，丰富用于栽培的菌株资源。

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（2020-02-10收稿 责任编辑：徐颖）