暹罗芽孢杆菌ZHX-10对花生冠腐病的生防效果

张 霞 许曼琳 于 静 吴菊香 李 莹 鄢洪海 李长友王晓强郭志青*迟玉成*

(1.山东省花生研究所,山东 青岛 266100;2.青岛农业大学植物医学学院,山东 青岛 266109;3.中国农业科学院烟草研究所,山东 青岛 266101)

花生在世界上许多地区都有种植,中国和印度为主要的生产国,其次是苏丹和尼日利亚[1]。花生占我国所有油料作物总产量的46%以上[2]。花生冠腐病是危害花生的重要病害之一,危害果仁、子叶和茎基部,以茎基部为主[3]。花生冠腐病又叫黑霉病、曲霉病、黑曲霉病和少亡病等[4],最早由Jochem 于1926 年首次报道了冠腐病在花生上的危害[5],该病是由黑曲霉(Aspergillusnigerv.Tiegh.)侵染引起的一种土传性真菌病害[6]。该病害可在感染花生种子中存活,通过种子传播[7],储藏期潮湿的种仁易受病菌感染,种子带菌率高达90%以上[8]。土壤带菌是另一种重要初侵染源,病菌可在土壤中存活1～2年[9]。花生冠腐病在印度和美国严重发生,每年引起花生产量损失5%左右,严重地区达40%[10]。在我国,冠腐病之前仅零星发生,不会造成重大经济损失,近些年重茬和抗病品种的匮乏导致病原菌连年累积,导致病害发生越发严重[11],一般造成缺苗10%左右,严重的在50%以上[12]。

针对花生冠腐病的防治工作,主要从种子处理和土壤处理两个方面着手。除轮作、加强田间管理等农业措施和种植抗病品种外,化学防治是控制土传病害的最有效措施。虽然目前国内尚无登记用于防治花生冠腐病的药剂,但也不乏研究者。李杨等[11]通过比较咪鲜胺、戊唑醇、醚菌酯、多·福对冠腐病的防治效果,发现戊唑醇在播种期或团棵期处理防效达到77%以上。苯醚甲环唑和咯菌腈包衣花生种子,对花生冠腐病和根腐病田间防效均在75%以上,由此增加产量[13]。虽然化学防治的优势有目共睹,但是由于人类健康和环境问题,寻找化学农药的替代品引起人们的关注[14],使用微生物控制植物病害是一个很好的选择[15]。如阳陵链霉菌3-10能够有效控制黄曲霉对花生的侵染,并能减少黄曲霉毒素的积累[16];短小芽孢杆菌LX11对白绢病菌表现出显著的抗菌活性,同时田间防效超过65%[17];多粘芽孢杆菌不但有效降低了冠腐病的发病率,还促进植物生长,增加产量[14]。

本研究使用的生防菌株ZHX-10从花生田中分离得到,对白绢病菌具有很好的拮抗作用[18]。试验测试了ZHX-10对冠腐病菌的拮抗作用,旨在为花生冠腐病的生物防治寻找有效的生防菌株。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

本试验所用的花生品种为花育917,由山东省花生研究所培育保存。

1.1.2 菌株

花生冠腐病菌菌株(A.niger)由本研究室分离保存。暹罗芽胞杆菌ZHX-10菌株(保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.15609)由本研究室分离保存。

1.1.3 培养基的配制

LB培养基和PDA 培养基的配制参考方中达的方法[19]。

1.2 测定项目和方法

1.2.1 ZHX-10和花生冠腐病菌平板对峙培养实验

花生冠腐病菌的活化:取5 μL花生冠腐病菌的保存液,接种到PDA 培养基中央,25℃暗培养7 d,备用。ZHX-10菌液的活化:挑取ZHX-10的单菌落,在LB 液体培养基中活化,150 r/min、28℃振荡培养12 h,离心后制备菌悬液,备用。吸取5 μL ZHX-10菌悬液,接种于PDA 固体培养基中央,28℃恒温培养24 h后,向PDA 培养基中均匀喷施冠腐病菌的孢子悬浮液。以不接种菌悬液为对照,每处理重复6次,25℃恒温黑暗培养7 d,测量抑菌圈直径大小。

1.2.2 ZHX-10挥发性气体抑菌活性测定

采用二分皿法测定挥发性气体的抑菌活性[20]。按照1.2.1的方法制备ZHX-10的菌悬液,并均匀涂布在二分格培养皿LB培养基侧,另一PDA 培养基侧中央位置接种10 μL冠腐病菌的孢子悬浮液,涂布50 μL无菌水为对照组,每处理重复6次。5 d后测量菌落直径,计算相对抑菌率。

相对抑菌率/%=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100

1.2.3 ZHX-10发酵液抑菌活性测定

将ZHX-10 的单菌落接种于LB 培养基中,28℃振荡培养24 h,10000 r/min离心10 min,收集上清液,用直径0.22 μm 滤膜过滤除菌。将无菌培养滤液以1:10的比例与加热冷却至40～50℃的PDA培养基混匀后倒平板,在平板中央接入10 μL冠腐病菌的孢子悬浮液,以添加等量LB培养基的平板为对照,每处理重复6次。25℃黑暗培养,7 d后测量菌落直径,计算相对抑菌率。

1.2.4 ZHX-10对花生生长的影响

将高油酸花生花育917种子消毒后,浸泡于用LB液体培养基培养24 h的ZHX-10菌液中,以浸泡于LB培养基中为对照。4 h后,播种于含ZHX-10菌液的灭菌基质中,以添加LB的基质为对照。每个处理重复3次,每个重复20粒种子。播种后7 d观测出苗率,15 d观测成苗率,30 d测定植株总鲜质量和总干质量(105℃杀青30 min,80℃烘干至恒质量)。

1.2.5 ZHX-10对花生冠腐病的防治

按1.2.4的方法培育花生苗,播种7 d后接种冠腐病菌的孢子悬浮液,14 d后调查发病情况。病害分级标准参考李杨等的0～4级的分级标准[11]。

病株率/%=发病株数/总株数×100

病情指数=∑(各级病株数×对应级数值)/(调查总株数×最高级数)×100

防治效果/%=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

图1 ZHX-10对冠腐病菌拮抗活性的测定Fig.1 Analysis of antibiotic activity of ZHX-10 against A.niger

1.2.6 统计分析

所有数据用DPS数据处理软件进行处理,差异显著性采用Duncan’s新复极差法测验分析。

2 结果与分析

2.1 ZHX-10对冠腐病菌丝生长的影响

由图1可看出,ZHX-10菌株对冠腐病菌具有显著的抑菌效果,抑菌圈直径24.3±1.21 mm。

2.2 ZHX-10挥发性气体对冠腐病菌菌丝生长的影响

由图2可看出,同对照相比,ZHX-10的挥发性气体极显著降低了冠腐病菌的生长,菌丝生长抑制率达16.47%,可见ZHX-10 挥发性气体对冠腐病菌菌落生长具有抑制效果。

2.3 ZHX-10发酵液对冠腐病菌菌丝生长的影响

由图3可看出,同对照相比,无菌滤液极显著减缓了冠腐病菌菌丝生长,抑制率达8.28%。说明ZHX-10的发酵液对冠腐病菌菌落生长具有一定的抑制效果。

2.4 ZHX-10对花生幼苗生长的影响

从表1可看出,对照组中花育917出苗率为93.33±2.89%,成苗率为96.49±3.04%;而ZHX-10处理的花生出苗率为96.67±2.89%,成苗率为100.00±0.00%,两者无显著差异,但ZHX-10极显著增加了花育917植株鲜质量和干质量,分别提高34.69%和28.44%。

图2 ZHX-10挥发性气体对冠腐病菌的抑菌作用Fig.2 The inhibitory effect of

图3 ZHX-10无菌发酵液对冠腐病菌的影响Fig.3 Effects of ZHX-10 culture

表1 ZHX-10对花生苗期生长的影响Table 1 Effects of ZHX-10 on peanut seedling growth

表2 ZHX-10对花生冠腐病的防治效果Table 2 Control effect of ZHX-10 against peanut crown rot

2.5 ZHX-10对花生冠腐病的生物防治

从表2可看出,对照组和处理组发病率都为100%,同对照相比,ZHX-10 处理的死亡率和病情指数均极显著降低,死亡率降低了85.71%,防效达到52.04%。

3 讨论与结论

细菌由于具有分布广、种类多、繁殖快、易培养、作用方式多样等特点,是最具有生防潜力和应用价值的微生物[21],其中以对芽孢杆菌的研究最为普遍[22],芽孢杆菌的生物防治能力主要通过抑制植物病原菌的生长、诱导植物产生系统抗性、同病原菌竞争生态位来实现[23]。国内外在开发和利用芽孢杆菌进行生物防治方面进行了广泛研究。厉彦芳等发现侧孢短芽孢杆菌B8及其发酵液能促进番茄生长并抑制番茄黄化曲叶病毒[24],贝莱斯芽孢杆菌在实验室和温室环境中均表现出对番茄细菌性枯萎病和香蕉枯萎病具有拮抗活性[25],阿氏芽胞杆菌H26-2 和暹罗芽孢杆菌H30-3既可以促进白菜生长,又可以缓解高温和干旱胁迫[26]。本研究所用的生防菌株ZHX-10为暹罗芽胞杆菌,可高效抑制冠腐病菌。

ZHX-10的菌悬液、挥发性气体、发酵液对冠腐病菌具有一定抑制效果,挥发性气体的抑菌率为发酵液的2倍,推测ZHX-10的抑菌物质在菌体、发酵液和挥发性气体中都有分布。虽然暹罗芽胞杆菌在促进花生生长、防治花生冠腐病方面鲜有报道,但是其他细菌方面有很多研究。如多粘芽孢杆菌不但有效降低了冠腐病的发病率,还促进植物生长,增加产量[14];枯草芽孢杆菌AF1促进花生生长,减轻冠腐病发病情况[27];铜绿假单胞菌GSE 18-R1促进花生生长,减轻冠腐病发病情况[28];木霉菌JAU60减少冠腐病约50%发生率[29]。灌根处理发现,ZHX-10能够促进花生生长,接种冠腐病菌后能降低冠腐病的病情指数,表现出明显的抗性,防效超过52%。

菌株ZHX-10能够产生某些高效的抑菌活性物质,可能是几种物质的单一作用,也可能是多种物质的协同作用,具体种类、结构、特性以及抑菌机理等尚不明确,还需进一步研究。这些数据为今后暹罗芽胞杆菌ZHX-10的在花生上防治冠腐病菌方面提供了研究基础。