青蒿的离体快繁技术研究

张 凤，刘 丽，黄锦荣，蔡梅玲

(广东省梅州市林业科学研究所，广东 梅州 514011)

1 引言

青蒿(ArtemisiaannuaL.)又被人们称为黄花蒿,为菊科(Compositae)蒿属(ArtemisiaLinn)一年生草本植物[1],于花蕾期采收，割取地上部分再将其切碎并晒干，古时候将之称为“菣”。入药具有清热、凉血、退蒸、解暑、祛风、止痒、止盗汗、防中暑等功效，用作阴虚潮热的退热剂。经常用于温邪伤阴，夜热早凉，阴虚发热，骨蒸劳热，暑邪发热，疟疾寒热，湿热黄疸等病症的治疗。广泛分布于我国各个地方、亚洲其他地区、北美洲以及欧洲东部也有生长[2,3]。青蒿素是青蒿的主要活性成分，它是一种新型的倍半萜内酯化合物，世界卫生组织将其称作“世界上唯一有效的疟疾治疗药物”，具有起效快、效果好、毒性低的抗疟性能[3～8]。虽然目前已经能够通过人工合成途径来获得青蒿素,但是人工合成成本太高,毒性和难度太大,还没能投入实际生产。因此，田间栽培的黄花蒿是药用青蒿素的原料来源。但是天然植物中的青蒿素含量普遍偏低,且不稳定,又因受环境因素的影响,品质难以控制,培育青蒿素含量高且稳定的新品种有着明显的应用价值。现今，以青蒿的叶片、腋芽等材料作为外植体进行组织培养与繁殖于一些报道上可见，但是由于对青蒿叶片、腋芽和花序的消毒条件难以把握，使得污染率较高，很难进行规范化生产[ 3,9，10]。本实验以青蒿茎段为外植体，采用MS与不同种类、浓度激素组合的培养基,研究了青蒿茎段的消毒条件、丛生芽的诱导以及根系的生长状况,旨在通过组织培养技术为青蒿的快速繁殖提供基础平台。

2 材料和方法

2.1 材料

露地栽培青蒿的带芽嫩茎，该材料是经测定的青蒿素含量较高的植株。

2.2 方法

2.2.1 培养基以及培养条件

用MS培养基作为基础培养基,附加蔗糖30 g/L ,琼脂7 g/L，附以不同比例的激素，pH值为5.5～6.0,121 ℃高温灭菌20 min 。培养条件为26±2 ℃，光照1500～2000 lux，每天光照12 h。

2.2.2 外植体的消毒

选取生长良好的青蒿嫩茎，剪去叶片，用流水冲洗掉表面的灰尘，在无菌工作台中先用70%乙醇浸泡30 s，再用0.1%的升汞分别消毒8 min、9 min以及10 min，然后用无菌水清洗6～8次。最后将无菌外植体切成1 cm左右的带节茎段，将切好的无菌茎段接种到培养基中。每瓶接种一个外植体，每个处理接种20瓶，大约15天以后，对污染率进行统计，找出最适宜的消毒时间。

2.2.3 不定芽的诱导

重新选取生长良好的青蒿茎段加以消毒，消毒过程中 0.1%的升汞消毒时间采用消毒效果最佳的消毒时间，消毒完成后，将无菌外植体放入配置好的不定芽诱导培养基中，每瓶接种一个外植体，每个处理接种20瓶。共设计了3种添加了IBA、6BA 的MS培养基，每20 d左右更换一次培养基。对丛生芽的生长情况进行统计，确定诱导效果最佳的培养基。

2.2.4 生根培养以及炼苗

共设计了3种添加了IBA、NAA的1/4 MS培养基,待苗长至2～3 cm 时,分成单株，除去基部的愈伤组织,接种于生根培养基中,7 d左右开始生根,15 d后开始炼苗，打开瓶盖 ,在瓶子里加入适量蒸馏水，置于室温下2～3 d。取出小苗,洗去根部的培养基，移栽到事先准备好的土壤中,浇透水,用塑料膜盖3 d ,然后定期浇水及观察，统计成活率可达90%以上。

3 结果与分析

3.1 外植体的消毒和不定芽的诱导

选取生长良好的青蒿嫩茎，剪去叶片，用流水冲洗掉表面的灰尘，在无菌工作台中先用70%乙醇溶液浸泡30 s,再用0.1%的升汞消毒8 min、9 min以及10 min。然后将无菌外植体切成1 cm左右的带节茎段，将其接种到丛生芽诱导培养基中，大约15 d以后，对污染率进行统计，结果见表1。

表1 0.1%的升汞不同消毒时间的消毒效果

注：标有不同英文字母者为差异达到0.05显著水平，下同

从表1中可以知道：不同消毒时间下污染率的差异十分明显。随着消毒时间的增加，污染率也逐渐降低，但是在消毒时间为10 min时，出现了极为严重的褐化现象，不利于青蒿丛生芽的进一步生长。因此，将0.1%的升汞的消毒时间控制在9 min左右较为适宜。

利用MS与不同浓度6-BA 与IBA激素组合的培养基,对青蒿茎段进行不定芽诱导,15 d以后，对不定芽的生长结果进行统计，以确定不定芽诱导效果最佳的培养基 (见表 2)。

表2 青蒿不定芽诱导实验

从表2中可以看出，在IBA的浓度为0.1 mg/L、6-BA的浓度为1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L时，青蒿茎段的不定芽诱导率都非常高，均达到了100%。且以上3种培养基中皆没有发现畸形苗和变异苗,由此可知青蒿不定芽繁殖遗传稳定性较好。1号培养基中芽苗呈深绿色并且生长状况良好，2号和3号培养基中，在茎段基部容易形成白色、疏松的愈伤组织，芽苗长势较差，并且产生的不定芽数量与1号培养基相比明显有所下降，说明高浓度的细胞分裂素并不利于丛生芽的生长。故1号培养基(MS+6-BA 1 mg/L+IBA0.1 mg/L)为丛生芽的最佳诱导培养基。

3.2 试验苗的生根

等到不定芽生长至2～3 cm 时,于MS+6-BA 1 mg/L+IBA0.1 mg/L培养基中选取生长几乎一致的芽苗切分成若干单株,除去基部的愈伤组织后转接到生根培养基上，过一段时间以后，对生根情况进行观察和统计。

表3 青蒿的生根试验

统计结果表明:1号培养基中生根率较低，仅在50%左右，2号和3号培养基中生根率较高，均达到了90%以上。随着IBA浓度的增加，主根数量并没有明显的增加，但是侧根明显更加发达，因此适当的增加IBA的浓度更加有助于实验苗的生根。然而研究发现，当IBA浓度达到2.0 mg/L时，根系较细，而2号培养基(1/4MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 1.5 mg/L)的生根情况最好,生根数量多且根系粗壮,并且芽苗种植以后，存活率高达90%以上，更适用于遗传学的研究,故此培养基为最佳生根培养基。

4 讨论

近些年来，药用植物越来越受到人们的亲睐，但随着人们对药用植物需求的增加，野生的药用植物，尤其是一些珍稀的药用植物，由于一直以来受到人类毫无节制地采摘,其资源早已不可能满足市场的需求。因此，植物组织培养技术已经成为保存这些珍稀药用植物资源不可或缺的技术手段，许多珍稀的药用植物已经利用组织培养技术实现了资源的保存，同时使市场的需求得到了解决[11～14]。

本研究以青蒿幼嫩的带芽茎段作为外植体，使用常规的培养基、消毒剂和植物激素，展开了消毒、丛生芽诱导、生根等一系列研究。但是本实验采用的培养基组合与其它研究的略有不同，同时本研究以茎段为外植体直接进行不定芽诱导，取材方便，容易消毒，省去了脱分化形成愈伤组织这一过程，节约了较多时间。但在研究中发现青蒿茎段中含有许多的酚类化合物，切芽时产生的创伤会将组织中的多酚氧化酶激活。该酶很容易被氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并渗透到培养基中，致使培养基褐化,同时给培养物的生长和分化带来严重的影响，甚至会造成培养物的死亡[15，16]。及时的转接能够有效防止褐变,有利于试验苗的健康生长。

本研究还发现6BA和IBA结合的MS培养基非常利于丛生芽的诱导，在本研究中选用的激素浓度下，青蒿茎段丛生芽的诱导率全部达到了100%,但是通过比较不定芽的数量和生长状况，MS+6-BA 1mg/L+IBA0.1mg/L是诱导产生丛生芽的最佳培养基。IBA和NAA结合的1/4MS培养基非常利于根的生成，生根率均达到了90%以上，但生根数量多且根系粗壮的NAA 0.1 mg/L+IBA 1.5 mg/L培养基是诱导生根的最佳培养基，栽种后存活率也达到了90%以上。本研究为工厂化培育优良无性系种苗提供了理论基础和一定的材料。