苯甲酸型芳香小分子的电喷雾多级质谱裂解规律

王天山，何春刚，文俏慧，刘沛铭，杨 媚

（海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

苯甲酸型芳香小分子广泛存在于药用植物与食用真菌中，是一类常见的天然物质，具有重要的生理作用和生物活性；是多种药用植物的抗肿瘤活性部位的主要化学成分，也是多种中药挥发油的主要化学成分[1-6]。其作为植物的次生代谢产物，普遍认为是经过苯丙氨酸途径合成的，与木脂素类和黄酮类化合物是同根同源的[7]。到目前为止，尚未有文献系统地报道这类芳香小分子的电喷雾多级质谱的裂解途径及其规律。本研究所选择的11种苯甲酸型芳香小分子化合物有羧酸，酯类和醛类，在苯环的间位和/或对位有1至3个羟基和/或甲氧基，是具有代表性的天然源的化合物。采用三重四级杆离子阱串联质谱分析，通过解析碎片离子的结构及裂解顺序，总结该类化合物的质谱裂解规律，可为该类化合物的结构分析和快速鉴定提供数据依据，也为研究其他同源的拥有相似结构单元的木脂素类和黄酮类化合物质谱裂解提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

实验仪器：Esquire HCT 型电喷雾离子阱质谱仪（德国Bruker公司）；FA1604型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）。

没食子酸三甲醚，自制；丁香酸，上海生工生物公司；香草酸、异香草酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、香草酸甲酯、异香兰素、对羟基苯甲醛，上海阿拉丁公司；丁香醛，分离纯化于药用植物香花暗罗；香兰素，自制；HPLC级甲醇，上海MACRON精细化工公司。

1.2 质谱条件

电喷雾电离离子源（ESI），采用ESI正离子和负离子扫描模式；扫描范围为m/z 50～300；扫描方式：自动一级质谱全扫描，手动多级质谱提取离子扫描；毛细管电压为104 Volt；扫描速度26000 m/z；样品通过蠕动泵以4 μL/min的速率送入离子源；喷雾电压3500 V；干燥气N2温度为300 ℃；流速8 L/min；雾化气N2压力为6.9×104Pa；引入少量氦气（约5.0×105Pa）作为多级质谱的碰撞气，同时可以提高离子的诱捕效率；多级质谱的碰撞能量为0.8 V。进样方式为直接进样；采用四舍五入法将离子的质荷比归整。

2 结果与讨论

2.1 羧酸类化合物的多级质谱裂解

选择5种苯甲酸衍生物作为研究对象，分别是没食子酸三甲醚（1）、丁香酸（2）、香草酸（3）、异香草酸（4）和对羟基苯甲酸（5）。在自然界中，苯甲酸的衍生物多被羟基及甲氧基取代，取代在苯甲酸的间位和对位，其中没食子酸三甲醚和丁香酸是在苯甲酸的间位和对位有3个取代基，而香草酸、异香草酸和对羟基苯甲酸在间位和对位有两个取代基。通过研究上述羧酸的多级质谱裂解碎片，阐述羧基及苯环上的取代基裂解的顺序及中性小分子或自由基的形式（表1）。

表1 羧酸类化合物1～5多级质谱裂解碎片Table 1 MSn fragment ions of acids 1～5

2.1.1 正离子[M+H]+模式羧酸的裂解途径

由质谱数据分析发现，没食子酸三甲醚和丁香酸这两种化合物总体存在两条裂解途径。第一条途径是先在-COOH上脱去CO2得到三取代苯与H+加合正离子，接下来是断裂取代基，在取代基中较优先断裂的是从甲氧基丢失甲基自由基。第二条途径是羧基与加合H+离子脱水生成酰基正离子或者直接脱羟基生成羧酸正离子。

没食子酸三甲醚的苯环上的间位和对位取代基均为甲氧基，其经过脱CO2和依次丢失三个甲基自由基（m/z 169，154和139）后，由酚式结构经烯醇式-酮式互变异构形成邻苯二醌的结构（m/z 124）。丁香酸的结构与没食子酸三甲醚相似，分析其二级碎片离子发现有[M+H-17]+（m/z 182）的二级碎片离子，对应的是丢失对位羟基自由基，然后加合离子H+迁移至对位形成间位二甲氧基苯甲酸正离子；另外一种方式是按照途径一得到的邻二酚离子m/z140再脱OH自由基（m/z 123）后苯环缩环裂解（m/z 95）（图1）。

图1 化合物1和2在[M+H]+模式下的多级质谱裂解Figure 1 Fragmentation pathway of 1 and 2 in[M+H]+mode

在化合物3～5中也存在与化合物1和2相似的裂解规律，即优先脱羧，脱水和脱羟基等中性小分子和自由基（图2）。采用多级碰撞诱导解离（CID）技术扫描香草酸和异香草酸的二级离子[M+H-CO2]+（m/z 125），发现有[M+H-CO2-14]+的三级子离子生成，对应于裂解掉一个CH2碎片；其可能的裂解方式是当甲氧基的邻位未被取代时，甲氧基上的氢经五中心过渡态迁移至邻位，断掉亚甲基的同时生成酮式结构；由于该酮式结构不稳定，随即发生酮式-烯醇互变异构恢复芳香体系生成酚式结构（m/z 111）。

2.1.2 负离子[M-H]-模式羧酸的裂解途径

图2 化合物3-5在[M+H]+模式下的多级质谱裂解Figure 2 Fragmentation pathway of 3-5 in[M+H]+mode

在负离子[M-H]-模式下，发现这5种苯甲酸类化合物有一种相同的裂解方式，先是脱CO2再断掉苯环上的甲基，另外也出现先断苯环上的甲基再脱CO2的过程，这两种过程都生成多取代苯酚负离子[M-H-59]-（图3、图4）。还发现化合物1有一个碎片离子比母离子m/z 196少了57 Da（[M-H-CH3-57]-），这可能是经过断掉甲基后发生缩环反应丢失C2O2H单元，生成二取代环戊二烯酮负离子m/z 139。化合物1经脱羧后，接下来再失去苯环上的甲基或者亚甲基，生成醌式（m/z 137）或者酚式负离子（m/z 153和123）。

图3 化合物1和2在[M-H]-模式下的多级质谱裂解Figure 3 Fragmentation pathway of 1 and 2 in[M-H]-mode

图4 化合物3-5在[M-H]-模式下的多级质谱裂解Figure 4 Fragmentation pathway of 3-5 in[M-H]-mode

2.2 酯类化合物的多级质谱裂解

香草酸甲酯（6）和对羟基苯甲酸甲酯（7）同是苯甲酸甲酯的衍生物，在间位和对位均有供电子基羟基和甲氧基。研究这两种化合物的多级质谱，以便获得酯基的开裂方式和苯环上的羟基和甲氧基裂解的顺序（表2）。

2.2.1 正离子[M+H]+模式酯的裂解途径

在[M+H]+模式下，芳香酯类化合物首先在酯基上发生裂解，断掉CH3OH和CO2的中性小分子，或者断掉CO2CH3自由基。该酯类化合物的酯基是经过三中心骨架重排使甲基迁移至苯环上的同时脱掉CO2分子，生成[M+H-CO2]+的甲苯型碎片离子，接下来断掉该甲基生成酚正离子，其结果与直接断掉CO2CH3自由基生成[M+H-59]+的碎片离子一样。另外，化合物6和7还存在[M+H-32]+的碎片离子，提示断掉1分子CH3OH生成苯甲酰基正离子；其中7 的苯环上没有OCH3，说明丢失的CH3OH 碎片来自酯基中的-OCH3和加合H+离子。该[M+H-32]+苯甲酰基正离子再依次从苯环上断掉甲基和羟基自由基。化合物6的m/z 136离子生成m/z 124的碎片离子是经过苯环缩环丢失一个CHO自由基，化合物7的酰基正离子m/z 121在苯环上脱水生成苯炔类正离子m/z 103（图5）。

表2 酯类化合物6和7的多级质谱裂解碎片Table 2 MSn fragment ions of esters 6 and 7

图5 酯类化合物在[M+H]+模式下的多级质谱裂解Figure 5 Fragmentation pathway of esters in[M+H]+mode

2.2.2 负离子[M-H]-模式酯的裂解途径

在负离子[M-H]-模式，酯类化合物在间位和对位存在羟基和甲氧基时，优先断裂的是酯基。酯类化合物常见的是先脱甲基自由基再脱羧。脱羧有两种形式，即脱-CO2H自由基和脱CO2分子。化合物6在MS2-3中分别观察到2个子离子依次减少15Da的离子为m/z 166和151，提示依次失去分子中的两个-CH3。化合物7 的酯基还出现了先经过三中心甲氧基重排脱去CO，生成比准分子离子m/z 151 少28Da 的碎片负离子m/z 123，该负离子再丢失1个甲基自由基生成对苯二醌负离子m/z 108。此外，还发现化合物7在酯基上脱CH2得到m/z 137，可能是按照五元环重排使甲基上的1个H迁移到CO的氧原子上而使CH2自由基断裂（图6）。

2.3 醛类化合物的多级质谱裂解

醛类化合物的结构与羧酸类和酯类化合物的结构相似，天然源的苯甲醛类衍生物的取代基集中在间位和对位，也是以羟基和甲氧基为主。以丁香醛（8）、香兰素（9）、异香兰素（10）和对羟基苯甲醛（11）为例，采用CID技术分别扫描准分子离子峰（[M+H]+和[M-H]-）和一些重要的碎片离子，得到的主要多级质谱裂解碎片列于表3。

图6 酯类化合物在[M-H]-模式下的多级质谱裂解Figure 6 Fragmentation pathway of esters in[M-H]-mode

表3 醛类化合物8～11的多级质谱裂解碎片Table 3 MSn fragment ions of aldehydes 8～11

2.3.1 正离子[M+H]+模式醛的裂解途径

在正离子[M+H]+模式，醛类化合物都一致优先从醛基上脱去1分子CO，得到比准分子离子少28Da的对应的酚醚类加合离子。接下来是断裂苯环上的甲氧基和羟基，并且甲氧基优先于羟基断裂；甲氧基可以断掉甲基自由基-CH3（8）和亚甲基-CH2-（9和10），也可以断掉甲氧基和甲醇分子的（8）。如果苯环上只有羟基的，就直接把羟基质子化而脱掉一个水分子（10和11）。最后是苯环的裂解，常见的也是脱去中性分子CO和自由基CHO（8和10）（图7）。

2.3.2 负离子[M-H]-模式醛的裂解途径

醛类化合物在负离子[M-H]-模式下的裂解方式较为多样化。其基本裂解规律是从醛基上脱CO 或者CHO自由基，比如化合物11在二级谱中由准分子离子m/z 121分别生成m/z 92和m/z 93的子离子；当苯环上有甲氧基时，则优先断裂掉甲基自由基生成醌负离子（化合物8依次断掉2个甲基分别生成m/z 166和151的醌负离子），或者断裂掉亚甲基自由基生成酚负离子（化合物10断掉亚甲生成m/z 137的酚负离子）；接下来醌负离子和酚负离子再从醛基上脱CO（图8）。

图7 醛类化合物在[M+H]+模式下的多级质谱裂解Figure 7 Fragmentation pathway of aldehydes in[M+H]+mode

图8 醛类化合物在[M-H]-模式下的多级质谱裂解Figure 8 Fragmentation pathway of aldehydes in[M-H]-mode

3 结论

选择研究了11种苯甲酸型芳香小分子的电喷雾多级质谱数据，通过分析碎片离子裂解的先后顺序，总结出该类型化合物的质谱裂解规律。研究结果发现，化合物在电喷雾质谱中裂解优先发生在主要的官能团，即羧基，酯基和醛基。第二阶段是脱去苯环上的取代基，主要是甲氧基和羟基，由于氧与苯环的p-π共轭效应使得C-O比较牢固，因此取代基的断裂优先从甲氧基上脱去甲基；当甲氧基的邻位未被取代时，常观察到从甲氧基经重排反应后丢失亚甲基，这一过程可能是经过五元环氢迁移到邻位得到酮式结构，该酮式结构再恢复芳香体系得到酚式结构。最后是苯环的裂解，常见的是发生缩环反应脱去CO或者CHO自由基。