基于近红外光谱技术快速检测青金桔果粉中微生物菌数

曾斯杰，马金爽，王 玥，刘彦弟，尹 星，韩长日，杨定国，刘 红*

（1.海南师范大学 化学与化工学院，海口市热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室，海南 海口 571158；2.海南科技职业大学，药食同源植物资源海南省重点实验室，海南 海口 571126；3.广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004）

青金桔，又名青桔、山桔、绿桔，属芸香科水果，果汁气味芳香、独特。青金桔富含维生素C、维生素A、维生素P和芳香油、类胡萝卜素等多种营养物质，对眼疾、咳嗽、哮喘、高血压、防止动脉硬化等疾病有一定保健作用[1-3]。青金桔果实经过清洗、榨汁、喷雾干燥、包装等工序制得青金桔果粉。果粉在储存过程中，人为改变高温高湿环境会促进微生物增殖。果粉中细菌或霉菌总数的快速检测，成为近几年研究的热点。

传统微生物总数的检测方法主要是微菌落技术法、全平器计数法、阻抗法、纸片法、平板计数法等[4-6]，其中平板计数法相对于其他方法，在精确度、敏感性、检测速度等方面都有了较大的提高，但仍存在操作过程繁琐，成本昂贵，易受温度、湿度、酸碱度等影响，而且检测周期太长，难以进行大批量检测。微生物检测只能通过抽检来进行，很难保证食品的安全性[7]。因此，寻找一种先进的快速检测技术来实现微生物总数检测势在必行。

近红外光谱技术是近年来快速发展起来的一种新的分析手段[8]，在食品的营养成分和微生物检测、掺假鉴定等方面应用前景广阔。近红外光谱技术具有快速、无损、无需预处理的特点，可用于乳酸菌、癌细胞、致病菌的检测，大大优于传统的微生物检测[9-12]。GHANI利用近红外光谱技术对HeLa和DU145细胞进行特征鉴别和含量测定[13]，FERNÁNDEZ 报道了近红外光谱检测生物膜表面金黄色葡萄球菌[14]，Treguier 利用近红外光谱从牛奶的微生物鉴别大肠杆菌和乳酸菌[15]。可见近红外漫反射光谱可用于食品中微生物的定量分析。

青金桔果粉在一定的湿度下，一定培养温度和时间适合微生物的生长。在27 ℃下适合酵母菌和霉菌、35 ℃有利于培养大肠杆菌等微生物的生长，如实验培养1～7 d，细菌总数明显增加。通过扫描不同温度下保存1～7 d的青金桔果粉的近红外光谱，获得果粉中大肠杆菌、酵母菌和霉菌等微生物含氢基团的特征信息，结合与样品微生物总数的测定值，利用偏最小二乘法建立预测模型以实现对青金桔粉菌落总数的快速检测[16-19]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青金桔原粉，海南南派实业有限公司;酵母浸膏，国药集团化学试剂有限公司；细菌琼脂粉，北京陆桥技术有限责任公司；胰蛋白胨，北京陆桥技术有限责任公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司。

SUP-NIR-1520近红外光谱分析仪，江苏润安光电箱公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥器，上海申贤恒温设备厂；MLS-3751L高温灭菌器，日本Panasonic。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

准确称取36 g青金桔原粉于灭菌烧杯中，加入4 mL超纯水，混匀后均匀的铺在直径为9 cm的无菌培养皿中。本实验共设置三组不同温度（0、27、35 ℃），培养1～7 d，每组8个样品（20 ℃样品做参考对照），每天取1个样品，共25个青金桔粉测试样品。

1.2.2 样品近红外信息的采集

为保证实验数据不受外界空气和其他条件影响，每天固定时间于三种温度下分别取一个样品进行近红外光谱扫描。波长范围为900～1700 nm，扫描次数为5次，仪器分辨率为8 cm-1，采样间隔为3.856 cm-1。运用近红外光谱分析仪分别对样品进行扫描，保存光谱数据。

1.2.3 样品菌落总数的测定

对采集近红外光谱图像信息后的样品进行菌落总数的测定。取出样品0.25 g，用超纯水溶解稀释至10 mL。参考GB 4789.2-2010中的10倍稀释法对样品依次进行稀释。将稀释后的样品置于培养皿中，并分别倒入霉菌、酵母菌、大肠杆菌的培养液，30 ℃摇床中培养6～8 d，通过平板划线法测出它们的总数。

1.2.4 模型的建立与验证

为保证实验结果的准确性，将每个样品扫描3次的光谱数据取平均值，分别与不同微生物的菌落总数相对应，并分成校正集（2/3）和预测集（1/3）。采用The Unscrambler 软件应用偏最小二乘法将测定值和光谱数据进行建模回归，建立青金桔粉的霉菌、酵母菌、大肠杆菌总数的预测模型。采用校正决定系数R2c 校正验证误差（RMSEC）以及交互验证决定系数（R2cv）、交互验证误差（RMSEC）作为评价指标判定定标模型的可行性，然后再用预测集进行验证，评价指标为预测标准偏差（RMSEP）、预测决定系数（R2p）。一般情况下RMSEC、RMSECV越小，R2c、R2cv、R2p越接近1，定标模型的预测能力越好，反之越差[20]。

2 结果与讨论

2.1 青金桔粉的近红外光谱分析

青金桔粉按照1.2.1 保存7 d，每天取样，扫描样品的近红外光谱，1～7 d 样品透射率在全波长（900～1700 nm）范围的变化关系如图1A所示。样品的透射率受温度影响较明显，其中原始温度（20 ℃）的反射率最小，0 ℃次之，35 ℃最大。近红外光谱显示葡萄糖在1681 nm处有吸收峰，而青金桔粉H2O含氢官能团吸收波长为1460 nm，波长越来越小，即这些分子含氢官能团振动所需要的能量依次增大[21]。

2.2 青金桔粉近红外光谱的主成份分析

将上述近红外光谱进行主成分分析，结果如图1B所示。贮藏温度对光谱数据的影响较大，0 ℃处理的青金桔粉在图中左侧，PC2 在67.9%～98.7%范围；27 ℃处理的青金桔粉在图的中部，PC2 在48.5%～57.9%范围，主要含有大量的霉菌和酵母菌；35 ℃处理的青金桔粉位于图中右侧，PC2在29.0%～48.5%范围，含有一定量的大肠杆菌。常温存放的青金桔粉（4号样品）PC2大于1，说明温度的变化引起青金桔光谱的反射率增大。

图1青金桔粉的近红外光谱和主成份分析Figure 1 Near-infrared spectra of green kumquat powder and principal component analysis

2.3 不同波长选择对青金桔粉各菌种建模和预测的影响

通过PLS法对青金桔粉各菌属在900～1700 nm和1300～1700 nm两个波段内的光谱数据和微生物总数进行建模分析，得出的青金桔粉微生物总数的预测模型，如表1所示。在波长900～1700 nm范围内，霉菌和酵母菌模型的校正、交叉验证和预测决定系数R2c、R2cv 和R2p 分别为0.9861、0.9839、0.9823 和0.8794、0.6506、0.8264，这说明霉菌和酵母菌在近红外光谱图的特征峰相对均匀的分布在900～1700 nm范围。而大肠杆菌模型的校正、交叉验证和预测决定系数在1300～1700 nm范围内，R2c、R2cv和R2p为0.9610、0.9570和0.9787，由此可以分析得到，运用近红外光谱检测大肠杆菌时，选择波长1300～1700 nm 能在减小工作量的同时，提高数据的稳定性。

表1 不同波长对各菌建模和预测的影响Table 1 Effects of different wavelengths on the modeling and prediction of various bacteria

2.4 不同光谱预处理方法对青金桔粉各菌种建模和预测的影响

对900～1700 nm范围内的霉菌和酵母菌，1300～1700 nm范围内的大肠杆菌的光谱数据分别使用平滑（S-G）、归一化和标准正态变化三种不同的预处理方式进行处理，通过PLS法建模并预测，得到的结果如表2所示。原始光谱的建模和预测效果整体更为稳定，而其他预处理方式能够得到更加稳定的建模数据，预测模型效果则不理想。这可能跟样品储藏时间过长，微生物生长的稳定态被破坏，在通过对光谱数据进行预处理后使预测模型波动太大导致。

表2 不同光谱预测方式对各菌建模和预测的影响Table 2 Effects of different spectral prediction methods on the modeling and prediction of various bacteria

2.5 微生物总数建模分析

采集不同温度、时间的霉菌、酵母菌和大肠杆菌中的菌落总数，每种菌种共25个测定值。从25组数据中随机选择16组作为校正集，用于模型建立；其余9组作为验证集，用于模型预测。利用The Unscrambler软件中的PLS将霉菌、酵母菌、大肠杆菌的光谱数据和微生物总数相关联，建立预测青金桔粉中霉菌、酵母菌、大肠杆菌总数的近红外模型（图2）。

图2 基于近红外光谱数据的霉菌总数、酵母菌总数和大肠杆菌总数PLS建模和预测结果Figure 2 PLS calibration and prediction results for the total mold counts (A1，A2)，the total yeast counts（B1，B2)and the total E.coli counts(C1，C2)based on near-infrared spectra

从图2可知，霉菌总数的近红外光谱数据模型的校正、交叉验证和预测的相关系数、和均大于0.98，均方根误差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于2.70（lg CFU/g），说明霉菌总数预测模型的拟合程度良好，真实值与预测结果具有一定相关性。酵母菌总数的近红外光谱数据模型的校正、交叉验证、预测的相关系数、、均大于0.65，均方根误差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于6.20（lg CFU/g），说明模型的拟合程度中等。大肠杆菌总数的近红外光谱数据模型的校正、交叉验证和预测的相关系数、、均大于0.93，均方根误差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于1.70（lg CFU/g），说明模型的拟合程度较好，数据预测较为准确。上述结果表明，近红外光谱可用大肠杆菌和霉菌总数测定，预测效果较好，而预测酵母菌总数模型可行，可能与酵母菌难以计数有关。

3 结论

在运用传统的平板计数法测定了在不同温度、时间下处理的青金桔粉中霉菌、酵母菌、大肠杆菌的菌落总数基础上，结合青金桔粉样品的近红外光谱数据，运用偏最小二乘法建立菌落总数的预测模型，青金桔粉中霉菌、大肠杆菌近红外光谱预测模型的相关系数均大于0.9，酵母菌的校正和预测模型的相关系数、均大于0.8，且它们的均方根误差RMSE都较小，从实验结果来看，所建立的模型可有效预测青金桔粉中的霉菌、大肠杆菌总数。