基于表型和SSR标记筛选海岛棉优异种质资源

马麒，宁新柱，李吉莲，陈红，余渝，林海

（新疆农垦科学院棉花研究所/ 农业农村部西北内陆区棉花生物学与遗传育种重点实验室/ 新疆兵团棉花改良与高产栽培重点实验室，新疆石河子832000）

海岛棉（Gossypium barbadenseL.）纤维具有长、强、细等特点，是高档和特种棉纺织品的重要原料，因其优异的纤维品质和黄萎病抗性，目前已成为最具利用价值的棉花栽培种之一[1-2]。 近年来，我国在海岛棉种质资源创新和新品种选育方面取得重要成果[3-6]，其产量得到较大幅度提高，纤维品质也得到明显的改善。 但我国海岛棉产量及纤维品质育种水平仍没有明显突破，其中优异种质资源的匮乏是主要原因之一。 因此筛选和挖掘海岛棉优异种质资源对于海岛棉新品种选育及资源创新具有重要意义。

种质资源是作物遗传育种工作的基础，植物新品种选育及生产的发展，很大程度上取决于掌握优异种质资源的数量和研究深度。 育种实践证明，一些具有关键性状的优异种质往往对育种成效起决定性作用[7]。 因此急需发掘符合育种目标和研究需要的优异种质，以满足当前和今后科研及生产发展的要求。 目前，已开展了包括大豆[8]、玉米[9]、小麦[10]等多种作物优异种质资源的分析与研究。 海岛棉是棉花常见的四倍体栽培种之一，约占我国植棉总面积的5%。 近年来，海岛棉种质资源数量较多、类型也较丰富，但海岛棉骨干亲本的广泛使用及定向育种策略，导致其遗传基础狭窄、遗传背景单一，海岛棉品种遗传多样性呈现明显的下降趋势[11-14]。 此外，部分具有重大科研价值的优异种质正在流失却未引起重视，而单一性状特别突出的优异海岛棉种质资源更是极其匮乏。 海岛棉优异种质的筛选不仅可为棉花科研和育种提供独特、优异、丰富的基础材料，而且在一定程度上可加速一些优异性状相关Quantitative trait locus(QTL)定位，为实现分子标记辅助育种、利用海岛棉进行陆地棉改良育种提供重要参考和依据。

随着分子生物学技术的快速发展, 分子标记已广泛应用于作物优异种质资源的筛选与发掘。简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）也叫微卫星，广泛分布于真核生物基因组的编码区和非编码区。 SSR 标记具有多态信息含量高、共显性遗传、重复性好、特异性强、技术简单、成本低等特点，已成为从基因型方面评价种质资源的重要工具[15]。一般来说，表型是生物遗传物质在环境作用下的外在表现形式，主要包括肉眼可见的外部特性，也包含色素、生理、品质等需要借助测试才可识别的特性[16]；基因型是生物个体全部基因组的总和，是性状表现的内在因素。 基于表型和SSR 分子标记技术来研究现有海岛棉核心种质资源的遗传变异情况，可深入了解其遗传背景信息，充分挖掘关键性状表现突出的优异种质。

本研究以前期构建的178 份海岛棉核心种质为试验材料，利用SSR 标记技术阐明海岛棉种质资源的基因型变异及亲缘关系；同时结合性状表型值，开展基于表型和基因型的海岛棉种质资源评价与筛选， 挖掘海岛棉核心种质的产量、品质构成性状中单一性状表现突出的优异种质，以期为海岛棉遗传育种及理论研究提供重要基础，同时也为其它作物优异种质资源的筛选与鉴定提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究以前期构建的178 份海岛棉核心种质为试验材料。 178 份材料中包含新疆本地选育品种/ 系 130 份（前期已发表[5]），国外引进材料26 份，内地引进材料22 份（附表1，见本刊网站）。

1.2 田间试验设计与表型性状调查

1.2.1田间试验设计。田间试验于2015―2016年在新疆生产建设兵团农二师29 团新疆农垦科学院棉花研究所试验站开展，种植模式是（66＋10）cm 株行距配置， 一膜四行， 每个材料种植2行，行长4 m，株距为9.5 cm。 田间采用随机区组设计，重复3 次，小区管理与当地大田相同。

1.2.2表型性状调查。本研究中调查和测定的表型性状主要是铃重、单株铃数、衣分、纤维长度、纤维强度和马克隆值6 个性状。 田间调查时，每个小区随机选取连续相邻的10 株作为调查对象，调查总铃数，并计算单株铃数；收获期每个小区随机收取棉株中部50 个考种铃， 称取籽棉总重量，并计算铃重；轧花后，称取50 铃的皮棉总重量，并计算衣分；取10 g 皮棉送原农业部棉花品质监督检验测试中心（HVICC 校准），测定纤维上半部平均长度、断裂比强度、马克隆值等品质指标。

1.3 棉花基因组DNA提取及SSR引物合成

苗期选取各个材料植株幼嫩叶片， 按Paterson 等[17]的方法提取基因组总DNA。 SSR 引物的选择参考了 Guo 等[18]、Lin 等[19]构建的棉花 SSR分子标记遗传图谱，引物序列信息参考棉花微卫星标记数据库（https://www.cottongen.org/data/markers）， 引物的合成由北京康为世纪生物科技有限公司完成。

1.4 多态性SSR引物的筛选及PCR反应

选取覆盖棉花26 对染色体的1 000 对SSR引物， 在12 份海岛棉种质间进行引物多态性筛选，得到156 对多态性引物。 选取其中条带差异明显、背景清晰、信号较强、扩增效果较好、都覆盖所有染色体的120 对多态性SSR 引物 （图1），对178 份海岛棉核心种质进行Polymerase chain reaction（PCR）扩增反应。 PCR 的扩增、电泳及染色参考 Zhang 等[20-21]的方法。

图1 代表性多态性引物在12 份海岛棉材料中的扩增情况Fig.1 Amplification of the representative polymorphic primers in 12 accessions of sea-island cotton

1.5 SSR分子标记的多态性、 群体结构及聚类分析

对于SSR 标记数据， 根据PCR 扩增产物的电泳结果采用0、1 系统记录谱带位置，观察某一扩增条带的有无，有带记为1，无带记为0，构建0、1 矩阵。利用 POPGENE 3.2 软件计算等位基因变异数和多态性信息量 （Polymorphism information content,PIC）。 利用 Structure 2.3.4 软件[22]估测该自然群体的遗传结构，计算每个材料对应的Q 值（即每个材料归属于某个亚群的概率），假定位点是独立的， 设定群体数目 K 为 1～10，MCMC 开始时的不作数迭代 （Length of burn-in period）为10 000，然后根据最大似然值原则选取合适的K 值。初选海岛棉优异种质的基因型聚类分析采用NTSYS-pc 2.10 软件，根据 SimQual 程序求Jaccard 相似系数，采用类平均法（Unweighted pair group method arithmetic averages, UPGMA），对遗传相似系数矩阵进行聚类并绘制树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 海岛棉核心种质表型性状的遗传多样性分析

从表1 可知，178 份海岛棉核心种质的平均铃重（3.04±0.23） g、衣分（31.42±2.25）%、单株结铃数 10.53±2.10、 纤维上半部平均长度（35.99±1.88） mm、 断裂比强度 （42.14±4.18）cN·tex－1、 马克隆值 3.80±0.32。 铃重变幅为2.29～3.58 g、衣分 22.17%～36.82 %、单株结铃数 5.4～17.4、 纤维上半部平均长度 26.78 ～38.62 mm、断裂比强度 31.95～53.50 cN·tex－1、马克隆值2.67～4.51。变异度分析发现，海岛棉核心种质表型性状具有较广泛的变异范围，6 个性状的变异系数为5.22%～19.94%，其中单株结铃数的变异系数最大，为19.94%，这说明单株结铃数性状的变异度最丰富，有利于筛选强结铃性的海岛棉优异种质。 多样性分析发现，单株铃数、纤维上半部平均长度、断裂比强度和马克隆值的遗传多样性指数较高，均大于1.000 0，且断裂比强度的多样性指数达到1.412 0，说明这些核心种质中断裂比强度的遗传多样性最丰富的。

表1 海岛棉表型性状的变化及分布特征Table1 The variation and distribution of phenotypic traits of sea-island cotton germplasm

2.2 基于SSR标记的遗传多样性分析

2.2.1多态性SSR 引物的筛选。利用1 000 对SSR 引物在12 份海岛棉材料间进行多态性引物的初选，得到156 对差异性引物，剔除扩增条带模糊、离散度低的引物，选取其中扩增效果较好的120 对多态性明显的SSR 引物（图1），用于海岛棉核心种质的基因型分析。

2.2.2海岛棉核心种质全基因组SSR 扩增结果分析。选取120 对多态性明显的SSR 引物，对178 份海岛棉核心种质进行SSR 标记的扩增分析 （图2）。 结果发现，120 对 SSR 引物共检测到262 个位点， 每对引物检测到等位变异的数目为1～6、平均为2.18；多态性信息含量在0.067 8～0.630 0，平均为 0.296 0，位于 0.25～0.50 之间，说明178 份海岛棉的不同位点多态性属中度多态（表2）。

图2 引物NAU3310 在海岛棉核心种质的扩增电泳图Fig.2 The amplified electropherogram of primers NAU3310 in core collection of sea-island cotton

表2 120 对SSR 引物的多态性分析Table 2 The polymorphism analysis of 120 pairs of SSR primers

表2 （续）Table 2 (Continuation)

2.2.3群体结构及聚类分析。由Structure 2.3.4软件分析显示，似然值 ln（P（D））随 K 值的增加而增加（图3a）。 根据 Evanno 等[23]的方法，由△K来确定 K 值。 由图3b 可知，K＝2 时，△K 最大并且出现显著的峰值，即该自然群体可划分为2 个亚群（图3c），亚群 1 和 2 分别包含 95 份和 83 份材料，且2 个亚群的材料均来自不同的地区和单位，说明各育种单位之间的种质资源发生了较为广泛的交换与融合。

2.3 海岛棉优异种质资源的筛选与鉴定

对178 份海岛棉种质资源进行2 年1 点的大田种植鉴定，剔除田间表现较差（早衰、抗病性差、产量低）的种质55 份，以123 份海岛棉种质作为优异种质的筛选对象。 铃重、衣分、单株铃数和纤维上半部平均长度、断裂比强度、马克隆值的表型值按照10%最优取样策略，在123 份海岛棉种质资源中筛选出铃重、衣分、结铃性、纤维长度、纤维强度最优种质和马克隆值最低的种质各12 份，作为初选海岛棉优异种质（表3）。 同时参考群体结构分析（图3）及初选海岛棉优异种质资源的基因型聚类分析（附图1，见刊网站），依据“同一聚类群择优选取”原则，在取样措施上分层取样、综合考虑，对海岛棉种质资源进行了合理客观的评价与筛选，最终筛选每个单一性状特别突出的优异种质资源各5 份（表4）。

由表4 可知，共筛选出具有不同突出性状的海岛棉优异种质资源共23 份，其中新海28 号具有铃重高、结铃性强和纤维强度高等优点；G-92、新海 21 号、垦绿 04-20-2、Pima 3-79、新海 47 号同时具有2 个突出性状。 这23 份海岛棉优异种质资源不仅可用作海岛棉常规遗传育种的亲本选择，而且可用于相关QTL 定位。

3 讨论

种质资源的遗传多样性及亲缘关系信息是育种工作的基础，对我国海岛棉品种的遗传多样性准确的评价可以为亲本的选配、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供预见性，这是育种目标能否成功实现的关键[2]。 本研究对已构建的178 份海岛棉核心种质资源的纤维产量及品质构成性状进行准确鉴定并开展遗传多样性分析。 研究发现6 个性状的变异度和遗传多样性较丰富，研究结果与王莉萍[24]、谢元元[25]的研究结论基本相似。 说明本研究中海岛棉核心种质资源较高的变异度高和丰富的遗传多样性，可以为海岛棉优异种质的发掘提供良好的基础。

表型性状有时并不能真实地反映种质间的内在差异性，需结合基因型的遗传变异来揭示种质间的遗传差异性。 分子标记可以为海岛棉种质的基因型分析提供重要工具，前人已利用不同分子标记对海岛棉的遗传多样性进行研究。 吴大鹏等[14]认为我国海岛棉品种遗传多样性适中；陈光等[12]、李武等[2]和米日古丽·马木提等[26]利用分子标记进行了新疆海岛棉遗传多样性分析，通过研究认为我国新疆海岛棉育成品种遗传背景相对较为狭窄。本研究利用SSR 分子标记对海岛棉核心种质资源进行了遗传多样性分析，研究发现其遗传基础同样比较狭窄。

图3 187 份海岛棉种质资源的群体结构分析Fig.3 Population structure analysis of 178 accessions of sea-island cotton germplasm

表3 海岛棉优异种质的表型筛选结果Table 3 The elite Sea-island cotton germplasm identified via phenotyping

表3 （续）Table 3 (Continuation)

目前，海岛棉骨干亲本的广泛使用及定向育种策略是造成其遗传基础狭窄、 遗传背景单一的最主要的原因之一。 长期的人工定向选择育种， 虽然使一些综合性状比较优良的材料积累下来， 但同时多数单一性状突出的育种材料正逐渐遭到淘汰和流失。 因此， 在表型鉴定基础上， 急需通过现代生物技术手段筛选和发掘单一性状突出的优异种质资源。 育种实践也证明，育种上的突破性成就多源于对某一关键性状特别突出的优异种质资源的发现和利用[7]。 本研究采用表型鉴定与基因型鉴定相结合的方法，筛选与发掘海岛棉优异种质资源， 即先通过表型鉴定结果初选海岛棉优异种质； 然后基于SSR分子标记进行基因型分析和亲缘关系聚类分析，综合表型变异和基因型变异情况，在取样策略上偏重评价、参考变异，在取样措施上分层取样、综合考虑，最终对海岛棉种质资源进行了合理客观的评价， 并最终筛选到海岛棉优异种质资源。 研究过程中既考虑了表型的变异度，同时也参考了基因型变异的结果， 在优异种质资源的筛选与鉴定的过程中实现了性状分析和鉴定的准确性和可靠性。

4 结论

本研究通过对178 份海岛棉核心种质资源进行表型和分子标记基因型的分析和评价，最终筛到单一性状突出的海岛棉优异种质资源共23份， 其中新海 28 号、G-92、 新海 21 号、 垦绿04-20-2、Pima 3-79 和新海 47 号同时具有 2 个或者2 个以上突出性状。 该23 份海岛棉优异种质资源不仅可以在海岛棉常规遗传育种中亲本选择时优先考虑， 而且可作为表型性状QTL 定位的关键材料利用。 本研究成果可以为海岛棉遗传育种及理论研究提供重要基础，同时也为其它作物优异种质资源的筛选与鉴定提供参考和依据。

表4 海岛棉优异种质资源的筛选结果Table 4 Screening results of elite sea-island germplasm