棉花花生间作田中花生蚜对吡虫啉代谢抗性机制初步研究

杨媛雪，李卓，段爱玲，薛超，须志平，赵鸣*

（1.山东棉花研究中心，济南250100；2.华东理工大学药学院，上海200237）

棉花是我国重要的经济作物，棉田间作模式多样。 花生作为重要的油料作物和经济作物，是棉花间作种植的主要作物之一。 棉花花生间作是一种集约利用农业资源、提高土壤肥力的优化种植模式，能够大幅提高产量、经济、生态及社会效益[1]。 合理的间作套种可以通过改变农田的生态结构和环境条件，提高天敌的种群数量，降低或抑制害虫的种群密度，进而起到有效控制害虫的作用。 同时，间作套种模式增加了田间作物物种的多样性，使作物的群体结构更加复杂[2]，不同间作作物病虫害发生的种类、抗药性、防治方法和防治时期均存在一定的差异，同时对不同作物上的一类害虫而言，在施药情况完全相同的情况下不利于抗药性的延缓。

棉蚜（Aphis gossypiiGlover）是棉花上的主要害虫，以直接刺吸汁液为害，同时排泄蜜露，影响棉花的光合作用， 还可作为媒介传播多种病毒，导致棉花产量和品质降低[3]。 花生蚜（Aphis craccivoraKoch.）又称豆蚜、苜蓿蚜，主要取食花生、豌豆、豇豆和苜蓿等豆科植物。 花生蚜是我国花生产区的一种常发性害虫，并且是花生病毒病的重要传播媒介， 严重影响花生产量和品质，一般年份减产5%～10%， 严重时达20%～30%[4]。吡虫啉是新烟碱类杀虫剂的代表， 由于其高效性、持效性以及对哺乳动物低毒而广泛应用于刺吸式口器等害虫的防治[5]，对许多种类的昆虫产生了抗药性。 自20 世纪末至今，粉虱、飞虱、马铃薯甲虫、 蚜虫等对吡虫啉产生抗药性相继被报道[3,6-9]。 吡虫啉在棉田和花生田中的应用都比较多，对蚜虫、蓟马、叶螨以及地下害虫都具有较好的防治效果。在棉花花生间作的农田中，蚜虫是2种作物上的重要害虫。 棉蚜对吡虫啉的抗药性机制研究相对较多， 而花生蚜的相关研究相对较少[4,10-11]。 本研究比较了棉花花生间作农田中棉蚜和花生蚜对吡虫啉毒力的差异，并初步探讨了花生蚜对吡虫啉代谢抗药性的机制，以期为该类间作农田合理用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

敏感品系的棉蚜为2016 年采自山东临清棉田，连续室内饲养，不接触任何杀虫剂的相对敏感品系。 敏感品系花生蚜为国家南方农药创制中心上海基地提供原始敏感品系，后经华东理工大学须志平副教授室内连续饲养，于2018 年赠与，饲养过程中不接触任何杀虫剂。 2 个花生蚜和棉蚜田间种群于2019 年分别采自山东巨野（JY）及山东临清（LQ）的棉花花生间作的田中。饲养条件为（25±1）℃、光周期 16 h∶8 h、相对湿度 70%～80%。

1.2 试验方法

1.2.1毒力测定。采用浸叶法对棉蚜和花生蚜进行毒力测定[12]。 将吡虫啉原药用二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解后，用含 0.05%（体积分数）TritionX-100 的清水将吡虫啉稀释成5 个系列浓度， 以含有体积分数为0.05%的TritionX-100 和1%的DMSO 的蒸馏水作空白对照。选择带虫棉花或花生叶， 剔除有翅成蚜和若蚜后，保留大小一致的无翅成蚜作为试虫，在药液中浸渍5 s 后，用干净的滤纸吸去多余的药液，详细记录各处理的试虫数后，放入养虫盒内。 每处理4 次重复，每重复不少于40 头。 将处理好的试虫置于温度（25±1）℃、相对湿度70%～80%、光周期16 h∶8 h 的人工气候室中饲养观察。 处理24 h 后，检查记录试虫死亡情况。

1.2.2酶抑制剂对杀虫剂毒力的影响测定。分别将顺丁烯二酸二乙酯（Diethyl maleate,DEM）、胡椒基丁醚（Piperomyl butoxide,PBO）和磷酸三苯酯 （Triphenyl phosphate,TPP）3 种酶抑制剂溶于DMSO 中， 并使用含体积分数为0.05%的TritionX-100 的清水将其稀释至 20 mg·L－1，于浸药前1 h 通过带虫浸液法处理2 种蚜虫。 随后进行杀虫剂毒力测定，24 h 后统计蚜虫死亡率。

1.2.3花生蚜解毒酶活力测定。（1）酶液制备。分别收集敏感品系、2 个地理种群活成虫，每处理重复3 次，冻于液氮中，用于后续所需的酶液制备。向冻存的蚜虫中加入1.5 mL 浓度为0.1 mol·L－1（pH 7.4） 的磷酸缓冲液， 进行冰浴研磨，于10 000×g（4 ℃）下离心 20 min，取上清液作为谷胱甘肽 -S- 转移 酶 （Glutathione S-transferase,GST）和羧酸酯酶（Carboxylesterase, CarE）的酶源，每个处理重复3 次。

向冻存 的 蚜虫中 加 入含 0.1 mol·L－1（pH 7.4）的磷酸缓冲液、1 mmol·L－1四元羧酸乙二胺四乙酸（Eethylenediaminetetaacetic acid, EDTA）、0.1 mmol·L－1二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）、1 mmol·L－1丙硫氧嘧啶 （Propylthiouracil,PTU）和 1 mmol·L－1苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF）的研磨液研磨后，于104×g（4 ℃）下离心 30 min。 取上清液，于 105×g（4 ℃）下离心60 min。用含体积分数20%的甘油研磨液重悬浮离心后的沉淀物，将其作为细胞色素P450单 加 氧 酶 （Cytochrome P450 monooxygenase，P450）的酶源，每个处理重复3 次。

蛋白含量使用考马斯亮蓝方法测定[13]。

（2）GST 酶活力测定。 向 30 μL 酶液中加入20 μL 浓度为 0.01 mol·L－1的还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）溶液，100 μL 浓度为 0.1 mol·L－1的磷酸缓冲液 （pH 7.4），80 μL 浓度为 0.01 mol·L－1的 1- 氯 -2,4- 二硝基苯 （CDNB） 溶液。27 ℃水浴条件下孵育20 min， 在340 nm 下测定OD值。 参考 Gao 等方法计算 GST 酶活力[14]。

（3）P450 酶活力测定。 取 450 μL 酶液，分别加入1 mmol·L－1烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH） 和 0.4 mmol·L－1的 7- 乙氧基香豆素各 25 μL，放置于 30 ℃下反应 30 min。 然后加入0.03 mol·L－1的氧化型谷胱甘肽 35 μL 和 0.5 U的谷胱甘肽转移酶35 μL， 于室温下静置10 min以除去荧光背景。 加入含体积分数50%乙腈的Tris 溶液 570 μL 以终止反应。 检测荧光值，激发波长为390 nm，发射波长为465 nm。 每处理重复3 次，参考 Kwon 等的方法计算 P450 酶活力[15]。

（4） CarE 酶活力测定。 取 30 μL 酶液，加入0.1 mol·L－1（pH 7.4）的磷酸缓冲液 40 μL，底物100 μL （0.3 mol·L－1的 α- 醋酸萘酯中含有0.01 mmol·L－1的毒扁豆碱）。 于 30 ℃下孵育20 min。 加入 30 μL 显色剂（质量分数为 1%固兰B 水溶液与5%十二烷基磺酸钠体积比2∶5，现配现用），室温下静置30 min，测定600 nm 下的OD值，每处理重复 3 次。 参考 Saito 的方法计算CarE 酶活力[16]。

1.3 数据统计分析

用SPSS 23 软件计算各供试药剂的毒力回归方程LC50和95%置信区间，利用t检验分析2组数据之间的差异显著性，数据表示为平均数±标准误，显著性差异水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 吡虫啉对棉蚜和花生蚜的毒力测定

毒力测定结果（表1）显示，巨野和临清2 个田间棉蚜种群的抗性倍数为43.2 倍和54.6 倍，达到了中等抗性水平。 巨野和临清2 个花生蚜田间种群的LC50分别是 2.971 mg·L－1和 1.313 mg·L－1，是室内敏感品系的 8.3 倍和 3.7 倍，分别处于低等抗性水平和敏感水平。

2.2 花生蚜中不同酶抑制剂对吡虫啉的增效作用

如表2 所示，在花生蚜中，3 种酶抑制剂对吡虫啉的增效作用不同。 在巨野种群中，PBO 和DEM 对吡虫啉都具有一定的增效作用，PBO 的增效作用较大，增效比达到了3.63，DEM 的增效比为1.95。 在临清种群中，只有PBO 对吡虫啉具有明显的增效作用，而DEM 和TPP 对吡虫啉不具有增效作用。由此推测，P450 和GST 在花生蚜对吡虫啉的抗药性中发挥重要作用。

表1 不同蚜虫种群对吡虫啉的抗性水平Table 1 Resistance of different populations of aphids to imidacloprid

表2 花生蚜中增效剂对吡虫啉增效作用Table 2 Synergic effects of synergist on the toxicity of imidacloprid in A.craccivora

2.3 花生蚜不同地理种群间解毒酶活性差异

花生蚜不同地理种群3 种解毒酶活性检测结果见表3。 巨野种群与敏感品系相比，CarE 活性没有显著性差异，而P450 和GST 活性前者显著高于后者。 在临清种群中，只有P450 活性显著高于敏感品系，而CarE 和GST 活性与敏感品系没有显著性差异。

3 讨论与结论

昆虫抗药性的分子机制主要包括靶标敏感性的降低和解毒代谢作用的增强[17]。 杀虫剂有效成分到达靶标的量只占进入体内总药量的很小一部分，大部分都被解毒代谢酶代谢后贮存于脂肪体中或排出体外。 因此，本研究中处于低水平抗性时期的田间种群主要是解毒代谢酶发挥作用[17]。 P450 是具有多重功能的超基因家族，在昆虫中，其可以通过羟基化、环氧化等作用代谢有机磷、拟除虫菊酯、新烟碱类等多种杀虫剂，使昆虫产生抗药性[17-18]。

表3 不同地理种群花生蚜解毒酶活性Table 3 The activities of detoxification enzyme in different A.craccivora populations

在昆虫中，某些P450 基因在对吡虫啉抗药性中发挥重要作用，如果蝇的CYP6G1[19]、家蝇的CYP6D1[20]、烟粉虱的CYP6CM1[6]、库蚊的CYP9M10[21]、褐飞虱的CYP6AY1、CYP6ER1、CYP4CE1、CYP6CW1[22]，其体外表达的蛋白质产物能够代谢吡虫啉。 Zhang 等在褐飞虱的研究中发现，PBO 能够增加抗性种群对吡虫啉的敏感性[23]， 表明P450 在田间抗吡虫啉的褐飞虱种群中发挥重要作用，这与本研究结果一致。 许多研究表明， 与杀虫剂解毒代谢相关的P450 基因通过表达量上调使蛋白量和活性升高。 在本研究中，PBO 降低了田间花生蚜种群对吡虫啉的抗药性， 并且抗性种群中P450 酶活性显著高于敏感品系，二者结果是一致的。 因此，认为P450 在花生蚜对吡虫啉的抗药性中发挥了重要作用，并且推断可能是一个或多个P450 基因调控作用的结果。P450 主要通过基因过量表达和点突变介导害虫抗药性。 因此，应进一步检测抗性种群与敏感品系中P450 基因序列以及表达量的差异， 找出关键P450 基因， 利用异源表达系统对上述鉴定到的关键P450 基因进行体外表达， 分离纯化表达的蛋白，并通过液质联通技术检测其对吡虫啉的代谢能力；利用RNAi 技术检测干扰后的田间种群对吡虫啉的敏感性变化，从而确定在花生蚜中对吡虫啉抗性具有作用的P450 基因， 进而明确花生蚜对吡虫啉代谢抗性的机理。

棉花花生间作是一种集约利用农业资源、提高土壤肥力的优化种植模式， 大幅提高了产量、经济、生态和社会效益[24]，但存在用药量大、害虫抗性增长等问题。 棉蚜是棉田中的一种主要害虫，目前防治方式主要以化学防治为主，药剂主要选择新烟碱类等杀虫剂等，这种对农药的依赖性导致棉蚜抗药性问题日益严重。 因此，棉蚜抗药性问题的研究相对较多。Hirata 等研究表明，棉蚜nAChR β1 亚基R81T 突变导致其对新烟碱类杀虫剂产生抗药性[25]；Peng 等研究表明，CYP6A2与棉蚜对螺虫乙酯抗药性相关，并且介导其与α-氰戊菊酯的交互抗性[26]；张国福等研究发现CYP6CY3 与棉蚜对吡虫啉抗性相关[27]；相关研究发现CYP6CY14、UTGs 与棉蚜对噻虫嗪抗性相关[18,28]。 本研究发现，2 种间作作物上的蚜虫对吡虫啉的抗药性存在显著性差异，2 个地理种群的棉蚜对吡虫啉的抗药性处于中等水平。 此结果与之前报道的结果一致， 崔丽等发现在河北廊坊、山东德州、新疆阿克苏和奎屯地区棉蚜对吡虫啉也处于中等抗性水平[3]。 而本研究发现2 个花生蚜田间种群对吡虫啉则分别处于敏感和低水平抗性，推测是由于近年来吡虫啉以拌种的形式应用于防治花生地下害虫，同时对苗期的花生蚜具有防治作用，但吡虫啉等新烟碱类杀虫剂在花生田中的应用相对比棉田少而导致其抗性水平还没有升高， 从而出现了在棉花花生间作田中，花生蚜和棉蚜对吡虫啉抗药性存在一定差异的现象。

综上，如在间作农田中对2 种作物上一致施药，不仅会导致花生田中农药的浪费，同时会对天敌产生不利影响，并且会加速花生蚜对吡虫啉抗药性的发生。 因此，建议在防治棉花花生间作农田中蚜虫时，应针对2 种作物分别施药，并且施药时间和施药次数都要有所差异，或者选择其他可替代的新烟碱类杀虫剂轮流使用，以此来降低吡虫啉等化学药剂对花生蚜的选择压，同时保护天敌、非靶标生物，并且减少环境污染和对植物的药害等，以科学有效防治该类间作农田中的蚜虫。