NGF-BMSCs移植对AD动物模型症状改善及对脑组织中凋亡相关基因Bcl-2、Bax水平的影响

梁金　谷新医　蒋志宏　马强

[摘要]目的 探討神经生长因子-骨髓基质干细胞（NGF-BMSCs）移植对阿尔兹海默病（AD）动物模型症状改善及对脑组织中凋亡相关基因B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bax水平的影响。方法 将50只AD大鼠随机分为5组，分别为对照组、盐水注射组、模型组、BMSCs移植组和NGF-BMSCs移植组，每组各10只。观察AD大鼠的行为学变化情况，检测大鼠海马区Bcl-2、Bax水平。结果 模型组和盐水注射组第1～6天的逃避潜伏期均短于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;BMSCs移植组、NGF-BMSCs移植组第1～6天的逃避潜伏期均长于对照组、模型组和盐水注射组，差异有统计学意义（P<0.05）;NGF-BMSCs移植组第1～6天的逃避潜伏期长于BMSCs移植组，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组、盐水注射组、BMSCs移植组、NGF-BMSCs移植组的Bcl-2、Bax水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;盐水注射组和BMSCs移植组的Bcl-2水平均高于模型组，Bax水平均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;BMSCs移植组和NGF-BMSCs移植组的Bcl-2均低于盐水注射组，差异有统计学意义（P<0.05）;NGF-BMSCs移植组的Bcl-2水平低于BMSCs移植组，Bax水平高于盐水注射组、BMSCs移植组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 NGF-BMSCs移植通过调节AD动物模型海马组织中Bcl-2、Bax表达水平抑制其神经细胞凋亡。

[关键词]神经生长因子基因-骨髓基质干细胞移植;阿尔兹海默病;动物模型;症状改善;凋亡基因

[中图分类号] R743          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）3（b）-0004-04

Effect of NGF-BMSCs transplantation on the improvement of symptoms in AD animal model and the levels of apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax in brain tissue

LIANG Jin   GU Xin-yi   JIANG Zhi-hong   MA Qiang

The Second Department of Neurology， Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University， Liaoning Province， Dalian   116000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of nerve growth factor-bone marrow stromal stem cells （NGF-BMSCs） transplantation on the improvement of symptoms in （AD） animal model and the levels of apoptosis-related genes B lymphocyte tumor-2 （Bcl-2） and Bax in brain tissue. Methods Fifty AD rats were randomly divided into five groups， namely the control group， saline injection group， model group， BMSCs transplantation group and NGF-BMSCs transplantation group， with 10 rats in each group. The behavioral changes of AD rats were observed， and the levels of Bcl-2 and Bax in hippocampus of rats were detected. Results The escape latency of the model group and the saline injection group from the first day to the sixth day was shorter than that of the control group， with statistically significant differences （P<0.05）. The escape latency of BMSCs transplantation group and NGF-BMSCs transplantation group from the first day to the sixth day was longer than that of the control group， model group and saline injection group， with statistically significant differences （P<0.05）. The escape latency of the NGF-BMSCs transplantation group from the first day to the sixth day was longer than that of the BMSCs transplantation group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The levels of Bcl-2 and Bax in the model group， saline injection group， BMSCs transplantation group， and NGF-BMSCs transplantation group were higher than those in the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The Bcl-2 levels in the saline injection group and the BMSCs transplantation group were higher than those in the model group， the Bax levels were lower than those in the model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of Bcl-2 in the BMSCs transplantation group and NGF-BMSCs transplantation group were lower than those in the saline injection group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The Bcl-2 level in the NGF-BMSCs transplantation group was lower than that in the BMSCs transplantation group， the Bax level was higher than that in the saline injection group and in the BMSCs transplantation group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion NGF-BMSCs transplantation can inhibit neuronal apoptosis in AD animal models by regulating the expression levels of Bcl-2 and Bax in hippocampus.

[Key words] Nerve growth factor-bone marrow stromal stem cells transplantation; Alzheimer′s disease; Animal model; Symptom improvement; Apoptotic gene

阿尔兹海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种常见的原发性中枢神经系统退行性疾病，由于我国人口老龄化现象的加剧，AD的发病率呈逐年上升的趋势，老年人为该病的高发人群，该病发病较隐匿，并呈缓慢进行性加重，临床表现主要包括认知功能障碍、行为异常和生活能力降低等[1]。AD的发病机制为脑部组织中海马区神经元受损，进而形成进行性的记忆减退病变。AD发病和海马神经元凋亡引发的神经损伤具有一定的关系。克隆的神经生长因子（nerve growth factor，NGF）能够延缓成年啮齿类动物的神经元退行性变[2]。相关研究表明，氧化应激是AD疾病发生发展的主要原因，而B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bax水平的高低对神经细胞凋亡、分化再生、代谢及修复等有重要的影响[3]。鉴于此，本研究旨在探讨NGF-骨髓基质干细胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）移植对AD动物模型症状改善及对脑组织中凋亡相关基因Bcl-2、Bax水平的影响，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物

50只成年健康SD大鼠，体重280～320 g，平均（300±50）g;均为雄鼠，由昆明医学院动物科提供，合格证号SXCK（皖）2011-002，适应性饲养7 d后用于实验。本实验符合动物实验伦理。

1.2主要仪器与试剂

1.2.1仪器  微型钻（东莞能者机电科技有限公司）、水浴锅（巩义市予华以期有限公司）、离心机（张家港市卓航机械有限公司）、通风柜（广州禄米实验室设备科技有限公司）、低速离心机（上海赵迪生物科技有限公司）、-80℃冰箱（邢台润联科技发展有限公司）。

1.2.2试剂  3.6%的水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，国药准字 H37022673）、β淀粉样蛋白（上海诚凛生物科技有限公司，粤械注准 20152400854）、3%的双氧水（南昌白云药业有限公司，国药准字 H36021594）、羊血清封闭液（北京索莱宝科技有限公司，国药准字 H200937495）、二氨基联苯胺（成都嘉叶生物科技有限公司，生产批号：20180303）、70%的酒精、80%的酒精、90%的酒精、95%的酒精、100%的酒精、二甲苯[上海瑞齐生物技术有限公司，生产批号：沪食药监械（准）字2013第1401615号]、液氮（新乡市鑫鸿低温容器制造有限公司）。

1.3实验分组及处理

1.3.1实验分组  50只成年健康SD大鼠随机分为5组，分别为对照组、盐水注射组、模型组、BMSCs移植组和NGF-BMSCs移植组，每组各10只。

1.3.2处理  构建NGF-BMSCs重组体，移植到AD大鼠海马区。制备AD大鼠模型：将3.6%的水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔注射至大鼠体内，麻醉后先将大鼠头皮切开，于前囟旁开2.0 mm，后开3.0 mm，向下3.0作为坐标，使用微型钻将颅骨钻开后进针，将10 μl的β淀粉样蛋白1-40（amyloid β，Aβ 1-40）注射到大鼠的双侧海马内。

对照组：大鼠未注射Aβ蛋白;盐水注射组：每只大鼠肌肉注射生理盐水2 ml;模型组：大鼠不做任何处理，正常饲养;BMSCs移植组：造模后7 d，选取双侧海马作为移植区，注射BMSCs细胞悬液;NGF-BMSCs移植组：造模后7 d，注射NGF-BMSCs细胞悬液。待大鼠完成移植术后的15 d，取待检样品进行水迷宫实验。

1.4观察指标

比较对照组、模型组、盐水注射组、BMSCs移植组、NGF-BMSCs移植组第1～6天的逃避潜伏期（在水中找到平台并爬上平台的时间，以此判断其行为能力）和凋亡相关基因水平，凋亡相关基因包括Bcl-2、Bax。

利用免疫组织化学染色法对大鼠海马组织中的凋亡基因Bax和Bcl-2水平进行检测。大鼠断头后取脑，将海马组织分离，放置在液氮中进行保存。将裂解液和蛋白磷酸酶抑制剂的混合物加入到大鼠的海马组织中，通过超声匀浆器将组织破碎后进行离心，取上清液为待检样品，以二步法进行测定。将3%的双氧水中置于37℃水浴锅进行孵育，时间为30 min;再加入5%的羊血清封闭液，孵育30 min;以Bax（1∶300）、Bcl-2（1∶400）的比例加入I抗体，置于4℃冰箱内过夜;再加入Ⅱ抗体，于37℃水浴锅进行孵育，时间为30 min。加入二氨基联苯胺进行显色处理，再行裱片和脱水：用水冲洗显色后的片子，分别将载玻片放到70%的酒精-80%的酒精-90%的酒精-95%的酒精-100%的酒精-100%的酒精-二甲苯-二甲苯，每个试剂中需放置2 min，于二甲苯中进行浸泡，搬至通风柜中。将中性树胶滴在海马组织旁，用盖玻片盖上后放平一侧，再轻放下另一侧，避免出现气泡，将片子封好后放到通风柜中进行晾干。

1.5统计学方法

采用SPSS 13.0统計学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组内、组间两两比较采用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组逃避潜伏期的比较

各组同组内第1～6天的逃避潜伏期比较，差异有统计学意义（P<0.05）;模型组和盐水注射组第1～6天的逃避潜伏期均短于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;BMSCs移植组、NGF-BMSCs移植组第1～6天的逃避潜伏期均长于对照组、模型组和盐水注射组，差异有统计学意义（P<0.05）;NGF-BMSCs移植组第1～6天的逃避潜伏期长于BMSCs移植组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2各组大鼠海马组织中Bcl-2、Bax水平的比较

模型组、盐水注射组、BMSCs移植组、NGF-BMSCs移植组的Bcl-2、Bax水平均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;盐水注射组和BMSCs移植组的Bcl-2水平均高于模型组，Bax水平均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）;BMSCs移植组和NGF-BMSCs移植组的Bcl-2水平均低于盐水注射组，差异有统计学意义（P<0.05）;NGF-BMSCs移植组的Bcl-2水平低于BMSCs移植组，Bax水平高于盐水注射组、BMSCs移植组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

3讨论

3.1 AD疾病的发病机制

AD是一种中枢神经性退行性疾病，临床表现为记忆力能减退、认知功能发生障碍及日常生活能力下降等，该病与患者的年龄密切相关[4]。目前，临床对于AD的发病机制尚未明确。研究显示，NGF保护了由β淀粉蛋白诱发的大鼠脑损伤[5]。海马区与学习记忆密切相关，广泛的海马神经元缺失是AD疾病的典型病理特征[6]。Bcl-2是一种具有抗凋亡作用的基因，而细胞凋亡是AD引发神经元丧失的重要原因[7-8]。Bax是一种促凋亡蛋白，其能够使线粒体外膜的通透性发生改变，最终引发细胞出现内源性的凋亡[9-10]。相关研究发现，在AD脑退化患者的神经细胞中，Bcl-2的含量显著降低，Bax的含量显著升高[11]。

3.2 AD的治疗机制

BMSCs是骨髓中除造血干细胞之外的另一种干细胞，BMSCs的作用是为造血干细胞构建造血系统微环境，并提供造血支持[12-13]。NGF表达上调及维持能够明显减轻AD患者的痴呆损害[14-15]。本研究对AD大鼠进行NGF-BMSCs移植，结果显示，NGF-BMSCs移植组第1～6天的逃避潜伏期长于模型组、BMSCs移植组，差异有统计学意义（P<0.05）;NGF-BMSCs移植组的Bcl-2水平低于BMSCs移植组，Bax水平高于BMSCs移植组，差异有统计学意义（P<0.05），提示NGF-BMSCs移植可使AD动物模型Bcl-2水平降低，Bax水平升高，改善学习和记忆能力。

3.3 NGF-BMSCs移植对AD动物模型神经凋亡因子的作用机制

植入骨髓基质干细胞能够对AD大鼠脑内细胞的神经凋亡起到抑制作用[16]。由于时间的推移，骨髓基质干细胞植入后使宿主脑内细胞发生变化，提高了抑制凋亡的效果[17]。骨髓基质干细胞能够向神经元样细胞进行分化，起到替代己坏死和凋亡的神经元的作用，并增加神经元数量[18];骨髓基质干细胞在脑组织中能够分化神经元样细胞及神经胶质样细胞，替代坏死、凋亡的神经细胞，有效改善患者的脑功能[19]。NGF-BMSCs重组体移植能够在患者前脑基底部发挥出减慢AD胆碱神经元退变的作用[20]。

综上所述，NGF-BMSCs重组体移植通过调节AD动物模型海马组织中Bcl-2、Bax表达水，显著改善了AD大鼠的神经学行为，对AD治疗研究提供了启示。

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（收稿日期：2019-11-07  本文编辑：任秀兰）