TLR4和肠道菌群在原发性肝癌进展中动态变化及与预后的关系

王雨 许达峰 周开伦 武金才 丁驿超 古海强 谢明微 林明花

原发性肝癌是全球最常见恶性肿瘤之一，致病因素多种多样，在我国，以HBV感染为主，可进展为肝硬化和或甚至肝癌，威胁生命安全[1-2]。Toll-样受体4(toll like receptors 4，TLR4)隶属于TLR家族，是机体天然免疫系统识别病原微生物的主要受体，在固有免疫反应及获得性免疫反应中均占有重要地位[3-4]。研究表明，TLR4可通过激活Toll受体结构域、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)及肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)等，诱导下游核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 活化，启动IFC轴[5]。肠道菌群是指寄居在人体肠道内所有微生物，研究发现其可通过调节宿主代谢和免疫功能等参与疾病的发生发展，疾病进展过程中菌群差异明显[6]。本研究探讨TLR4和肠道菌群在原发性肝癌进展中动态变化，并分析其与临床病理及预后之间的关系。

资料与方法

一、一般资料

选取2015年1月至2017年6月于本院诊治的100例慢性乙型肝炎、80例肝硬化合并乙型肝炎和60例肝癌合并乙型肝炎作为研究对象，诊断均符合《内科学·第8版》对应疾病的诊断标准。纳入标准：①肝癌患者临床分期Ⅰ-Ⅲ期；②所有肝癌患者均给予根治性手术治疗；③所有患者资料均完整；排除：①合并其他类型肝炎患者；②合并其它恶性肿瘤者；③合并其他胃肠道疾病者；④近1月内未给予任何治疗者。乙型肝炎组：男65例，女35例；平均年龄(45.8±7.2)岁；肝硬化组：男53例，女27例；平均年龄(45.2±6.8)岁；肝癌组：男41例，女19例；平均年龄(46.1±7.7)岁；3组在性别、年龄等一般资料上比较，差异无统计学意义(P>0.05)。另选取同期年龄及性别与前3组匹配的100名健康体检者作为对照组。所有研究对象均知情并签署同意书，并已通过本院伦理委员会审核批准。

二、各组外周血单核细胞表面TLR4表达检测

入组后第1天，抽取各组研究对照空腹静脉血3 mL于EDTA抗凝管，充分混匀；流式细胞术检测单核细胞表面TLR4表达：每份血液标本有2支试管(各含100 μL抗凝血血液标本)，1支分别加入FITC-CD14单抗(5 μL)和PE-TLR4单抗(5 μL)，另一支试管加入PBS液(5 μL)，充分摇匀，4℃静置30 min，后向2支试管中加入2 mL红细胞裂解液，震荡混匀，室温避光静置20 min，PBS洗涤2次，离心弃上清，加PBS调整浓度，上流式细胞仪检测CD14+TLR4+单核细胞阳性率。

三、肠道菌群分布检测

收集各组新鲜大便，取0.5 g标本按10倍系列稀释法将其稀释，后分别用MRS琼脂培养基、双歧杆菌BS培养基、肠球菌培养基和麦康凯琼脂培养基培养乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌及大肠埃希菌，培养2～3 d后用法国梅里埃公司生产的半自动微生物鉴定仪及软件进行鉴定，并计算每克粪便湿重中菌落形成单位对数值(lg CFU/g)。

四、随访

对60例肝癌患者进行随访，记录1年内其复发和生存情况。

五、统计学方法

结 果

一、各组外周血单核细胞表面TLR4表达水平比较

对照组、乙型肝炎组、肝硬化组和肝癌组外周血CD14+TLR4+单核细胞阳性率分别为(34.92±4.79)%、(41.92±7.46)%、(49.21±8.83)%和(57.62±10.58)%，4组比较，差异有统计学意义(F=78.624，P<0.01)其中乙型肝炎组高于对照组(t=7.896，P<0.01)，肝硬化组高于乙型肝炎组(t=6.002，P<0.01)，肝癌组高于肝硬化组(5.120，P<0.01)。

二、各组肠道菌群分布比较

4组乳酸杆菌和双歧杆菌含量依次减少，4组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；4组肠球菌和大肠埃希菌含量依次增多，4组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组肠道菌群分布比较(lg CFU/g,±s)

注：与对照组比较，①t=7.260；②t=5.814；③t=10.149；④t=9.044；与乙型肝炎组比较，At=6.197；Bt=4.197；Ct=6.600；Dt=8.588；与肝硬化组比较，at=5.706，；bt=8.193；ct=5.125；dt=4.309;均P<0.01

三、单核细胞表面TLR4表达与肠道菌群分布的关系

经Pearson相关分析得知，单核细胞表面TLR4表达与乳酸杆菌和双歧杆菌呈负相关(r=-0.643，P=0.012；r= -0.672，P=0.021)；与肠球菌和大肠埃希菌呈正相关(r=0.771，P=0.008；r= 0.734，P=0.010)。

四、单核细胞表面TLR4表达与肝癌患者预后的关系

随访1年，60例肝癌患者中，18例复发，15例死亡。复发者外周血CD14+TLR4+单核细胞阳性率为(59.32±9.17)%，明显高于未复发者的(55.21±5.23)%，差异有统计学意义(t=2.200，P=0.032)；死亡者外周血CD14+TLR4+单核细胞阳性率为61.04±10.23)%，明显高于生存者的(53.29±8.11)%，差异均有统计学意义(t=2.998，P=0.004)。

五、肠道菌群分布与肝癌患者预后的关系

与未复发者比较，复发者双歧杆菌和乳酸杆菌含量明显减少，但肠球菌和大肠埃希菌含量则明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与生存者比较，死亡者复发者双歧杆菌和乳酸杆菌含量明显减少，但肠球菌和大肠埃希菌含量则明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 肠道菌群分布与肝癌患者预后的关系(lg CFU/g,±s)

注：与复发者比较，①t=3.305；②t=3.691；③t=3.441；④t=3.596；与死亡者比较，At=4.596；Bt=4.288；Ct=4.382；Dt=4.437;均P<0.01

讨 论

在TLR家族中，共有10个基因(TLR1-TLR10)可介导机体免疫功能[7]。TLR4是一种跨膜蛋白，主要包含3个结构域：胞内结构、跨膜结构和胞外结构[8]。其中，胞内结构主要包含Toll 受体结构域；而胞外结构则包含多个亮氨酸重复序列，可特异性识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)[9]。近年研究发现，在乙型肝炎中TLR4识别PAMP后可激活MyD88-NF-κB信号通路，上调肝脏相关炎症因子、趋化因子及相关介质，最终使肝脏发生病理改变[10]。在本研究中，对照组、乙型肝炎组、肝硬化组和肝癌组外周血CD14+TLR4+单核细胞阳性率呈逐步升高，提示TLR4可促进HBV-肝硬化-肝癌进程，这与周东晓等[11]学者部分结论基本一致，但其与肝癌预后的关系尚不清楚。随访1年发现，复发者外周血CD14+TLR4+单核细胞阳性率明显高于未复发者，死亡者外周血CD14+TLR4+单核细胞阳性率明显高于生存者，提示TLR4与肝癌预后密切相关，有望成为肝癌预后监测及评估的重要指标。

肝脏是人体最大的代谢器官，此外，其还具有一定的免疫调节功能[12]。在长期进化过程中人体肠道形成了稳定的肠道菌群，约有10万亿个，其中可被培养的有400多种，主要分为以双歧杆菌为代表的优势菌群和以大肠埃希菌为代表的次要菌群，其代谢产物主要由肝脏门脉系统完成分解及排放，与肝脏关系密切，共同承担着调节代谢和免疫的作用[13]。当人体患肝病时，代谢解毒能力明显降低，而肠道菌群多样性降低，有害菌群数量及代谢产物明显升高，构成恶性循环，加重肝脏损伤[14]。近年，肠道菌群与肝脏代谢的关系逐渐成为治疗和预防肝病的热点之一。而粪便是肠道菌群和宿主代谢产物的共同排泄方式，在一定程度上可以反映肠道菌群状态[15]。本研究肠道菌群优势菌群代表双歧杆菌和乳酸杆菌在慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者和肝癌患者中依次减少，而其有害菌群代表大肠埃希菌和肠球菌则依次升高，提示肠道菌群变化与HBV-肝硬化-肝癌进展密切相关。此外，与未复发者和生存者比较，复发者和死亡者双歧杆菌和乳酸杆菌含量明显减少，但肠球菌和大肠埃希菌含量则明显升高，提示肠道菌群变化在肝癌预后预测中也具有一定价值。综合以上结果，不难发现TLR4和肠道菌群变化在HBV-肝硬化-肝癌进展及肝癌预后预测中都有一定价值，为此，本研究进行了Pearson相关检验，发现单核细胞表面TLR4表达与乳酸杆菌和双歧杆菌呈负相关，与肠球菌和大肠埃希菌呈正相关，说明TLR4表达水平越高，乳酸杆菌和双歧杆菌水平越少，而肠球菌和大肠埃希菌则越多，提示TLR可能与肠道菌群相辅相成共同影响着肝脏结构。

综上认为，TLR4可促进乙型肝炎进展为肝癌，与肠道菌群变化明显相关，两者在肝癌预后监测中有一定价值。但关于TLR4与肠道菌群中的相互作用机制及对肝癌进展的影响尚不清楚，有待后续继续探讨，且未涉及其在肝癌预后监测的具体价值分析。