转化生长因子β1诱导肺支气管上皮细胞发生上皮间质转化

郭佳，落继先

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）是最早发现的一类多功能细胞因子，在胚胎发育、血管生成、免疫调节、炎性反应、组织修复与器官纤维化，以及细胞的增殖、分化和凋亡等生理病理过程中具有重要作用[1]。TGF-β分为很多种，其中最受关注的是TGF-β1。TGF-β1 信号转导通路的异常与多种疾病的发生、发展密切相关，例如口腔鳞癌、乳腺癌和膀胱癌等[2]。TGF-β1 通常以自分泌或旁分泌的方式作用于细胞，诱导细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesen⁃chymal transition，EMT）。TGF-β1 通路与 EMT 进程密不可分[3]，因此 TGF-β1 常常作为 EMT 发生的阳性对照物[4]。

EMT 是指上皮细胞失去特性获得间质细胞表型的一种现象。EMT 分为3 类：Ⅰ型EMT 与胚胎发育进程有关；Ⅱ型EMT 与创伤愈合、组织再生和器官纤维化的过程有关；Ⅲ型EMT 发生在肿瘤的侵袭转移过程中[5]。Ⅰ、Ⅲ型EMT 较为相似，都是形成新的上皮细胞，而Ⅱ型EMT 则发生组织和器官纤维化。尽管EMT 类型各异，但都具有相同的生化背景，所以在生物学标志物和研究方法上有许多共通之处。

EMT 的标志性变化包括细胞形态学和基因的表达量[6]。细胞形态学的改变包括具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞[7]；在EMT 过程中，上皮细胞失去原有的细胞形态和特征，变成类似间质细胞的纺锤形[8]。基因表达量的改变包括：①α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达量增加。α-SMA 是肌成纤维细胞的重要组成蛋白，能够控制收缩肌细胞特异性运动，其含量间接反映肌成纤维细胞的增殖、活化状态和纤维化程度[9]；②β连环素（βcatenin）逐渐由细胞质更多地进入细胞核。βcatenin 具有双重调节功能，并且能够独立发挥调节作用，一是作为一种重要的细胞间黏附分子和细胞骨架成分，与E-钙黏蛋白（E-cadherin）结合形成复合体均匀分布在细胞膜上，参与调节细胞黏附；二是参与Wnt 经典信号转导，在肿瘤的发生发展和转移过程中发挥重要作用[10]；③锌指转录因子1（SNAI1）表达量增加。SNAI1 具有促进肿瘤细胞EMT 和肿瘤细胞的侵袭与转移的作用，SNAI1 表达量升高会下调E-cadherin 的表达量，促进细胞转移[11]；④E-cadherin 表达量减少。E-cad⁃herin 是上皮细胞间黏附分子，E-cadherin 表达量减少，会减弱上皮细胞间的相互作用[12]。

在本研究中，我们采用TGF-β1 刺激人肺支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells，HBEC），观察细胞形态和检测EMT 标志基因mRNA 的表达量，研究 TGF-β1 对 HBEC 的影响。关于EMT 已有一些研究，加深对EMT 相关调控因子的探讨，不仅有助于更好地理解EMT 的发生，而且为了解肿瘤转移与复发机制提供了新思路，同时以EMT 为靶点的抗肿瘤新型药物的研发也将是一个新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

HBEC 购于中国科学院细胞库，用含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素、链霉素）的DMEM 高糖培养基，在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。

DMEM 高糖培养基购于Gibco 公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；TGF-β1 购自 PeproTech 公司；反转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ购于TaKaRa 公司；TRIzol 购于 Invitrogen 公司；DAPI 和FITC-鬼笔环肽购于索莱宝公司。

1.2 形态学观察

将HBEC 消化离心后制成细胞悬液，接种于6孔板中，加入DMEM 高糖培养基培养，直至细胞贴壁均匀生长至70%左右，加入约2 mL DMEM高糖培养基（无血清），过夜饥饿细胞16 h 后加入TGF-β1（10 ng/mL），每天固定时间换液（含 10 ng/mL TGF-β1 的完全培养基）。培养0、1、2、3、4和5 d 时观察细胞形态并拍照。

1.3 免疫荧光技术

实验组用10 ng/mL TGF-β1 处理HBEC 4 d（对照组用PBS，其余条件完全一致），然后将2 组细胞铺板，PBS 洗涤2 次；4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS 洗涤 3 次，每次 10 min；用 1% Triton-100 室温下透化 15 min；加入 200 μL FITC-鬼笔环肽（5 μg/mL），覆盖玻片上的细胞，室温避光孵育 30 min，PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 min；用 200 μL DAPI 溶液（100 nmol/L）对细胞核染色5 min，PBS 洗涤盖玻片，滴加封片剂封片；于显微镜下观察并拍照。

1.4 实时荧光定量PCR实验

从 NCBI 数 据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取人SNAI1、E-cadherin、α-SMA和β-catenin的基因转录本，利用Primer 5 设计特异性引物（引物序列见表1）。将引物进行PCR 验证后用于实时荧光定量PCR 实验。

用TRIzol 提取细胞总RNA，逆转录为cDNA。利用ABI7500 实时荧光定量PCR 仪进行实时荧光定量PCR，检测EMT 标志基因的mRNA 表达量。15 μL 反应体系包括SYBR green Premix Ex TaqⅡ 7.5 μL，灭菌双蒸水 3.45 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.3 μL，上、下游引物各 0.375 μL（10 μmol/L），cDNA 3 μL。空白对照组模板为灭菌的双蒸水。反应程序为 50℃ 2 min、95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min，40 个循环。反应结束后，记录扩增曲线、熔解曲线及样本的循环阈值（Ct），以GAPDH为内参基因，通过 2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量[13]。每个样品同时设3 个重复。

1.5 统计学分析处理

运用SPSS18.0 统计学软件对所获数据进行分析，实验结果用x±SD表示，采用 ANOVA 单因素方差分析检验实验组和对照组间差异的显著性，2组组间比较采用t检验，*P＜0.05 表示差异显著，**P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 TGF-β1可以诱导HBEC发生类似EMT的形态改变

HBEC 经 10 ng/mL TGF-β1 处理 0、1、2、3、4和5 d 后，用相差光学显微镜观察，结果见图1。TGF-β1 刺激 2 d 时就可以诱使 HBEC 发生类似EMT 的形态改变，3、4 和 5 d 处理组尤为明显。HBEC 空白对照组呈经典的鹅卵石上皮细胞形态，但是经过TGF-β1 处理后，细胞形态逐渐变为纺锤形，更多地呈现间质纤维细胞形态（类似EMT 形变细胞已用红色箭头标出）。

表1 引物及序列

图1 TGF-β1 诱导 HBEC 形态变化

2.2 TGF-β1引起细胞骨架发生改变

实验组用10 ng/mL TGF-β1 处理HBEC 4 d（对照组用PBS，其余实验条件完全一致），在显微镜下观察HBEC 骨架，结果如图2。与对照组相比，TGF-β1 处理HBEC 4 d 时细胞骨架发生明显改变，逐渐变为纺锤形（红色箭头）。

2.3 TGF-β1对HBEC中EMT标志基因mRNA表达量的影响

利用实时荧光定量PCR 检测TGF-β1 处理细胞 0、1、3 和 6 h 的 mRNA 表达量。如图3 所示，与对照组相比，SNAI1在 3 h、E-cadherin在 6 h 的mRNA 表达量显著升高，α-SMA和β-catenin在各时间点mRNA 表达量都显著下降。

图2 TGF-β1 诱导细胞骨架变化

图3 TGF-β1 处理 HBEC 0～6 h EMT 标志基因 mRNA 的表达量

利用实时荧光定量PCR 检测TGF-β1 处理细胞 0、1、2、3、4 和 5 d 的 mRNA 表达量。如图4 所示，与对照组相比，SNAI1在 1 d 时的 mRNA 表达量极显著上升，而后各时间点的mRNA 表达量都呈现不同程度的下降，2、4 和 5 d 的 mRNA 表达量显著下降；α-SMA在 1 d 时的 mRNA 表达量极显著上升，而后各时间都呈现不同程度的下降，3 和4 d 的 mRNA 表达量显著下降；E-cadherin在 2、3和 5 d 的 mRNA 表达量都显著下降；β-catenin的mRNA 表达量在不同时间点均无显著变化。

3 讨论

本研究所用细胞为人正常支气管上皮细胞，其发生EMT 为Ⅱ型EMT-组织纤维化。免疫荧光及形态学观察证实细胞形态发生改变，与对照组相比，10 ng/mL TGF-β1 处理组细胞伸展状态发生明显改变，细胞形态逐渐变为纺锤形，从这种意义上来说，由TGF-β1 诱导的HBEC 发生的EMT属于Ⅱ型EMT。细胞从接收刺激到做出反应需要一定的时间。本研究实验结果表明，TGF-β1刺激HBEC 后，转录因子SNAI1 分别在3 h 和1 d做出了响应（图3C 和图4C）。SNAI1在 3 h 时mRNA 水平的上调，可能与SNAI1 所调控应激性基因的表达有关；TGF-β1 刺激细胞 1 d 时，SNAI1的mRNA 表达量增加到对照组的2.5 倍左右（图4C）。这提示我们，由SNAI1 调控的靶基因可能会随之升高或降低其表达量。SNAI1 通过结合E-box 抑 制 E-cadherin 的 转 录[14]。 结 果 表 明 ，E-cadherin的 mRNA 表达量在 TGF-β1 处理细胞 2、3和5 d 时均显著下降，虽然在TGF-β1 刺激4 d时，较对照没有显著差异（图4D）。

图4 TGF-β1 处理 HBEC 0～5 d EMT 标志基因 mRNA 的表达量

我们的研究还发现，在TGF-β1 刺激6 h 内，α-SMA和β-catenin的 mRNA 表达量均显著降低（图3A 和图3B），E-cadherin的 mRNA 表达量在 6 h 时显著升高（图3D）。这似乎与EMT 的发生需要一定的时间有关。在本研究TGF-β1 刺激0～5 d 的时间范围内，SNAI1和α-SMA的 mRNA 表达水平先升高后下降（图4C 和图4A），E-cadherin的mRNA 表达量在 2、3 和 5 d 都显著下降（图4D），标志着EMT 的发生；在4 d 时无差异，原因可能是发生刺激后首先响应应答，而后随着刺激时间的延长，正常细胞具有一定的自我调节修复能力，通过自我调节修复能力回到正常表达水平。而β-catenin的mRNA 表达量并未发生改变（图4B），推测是β-catenin 在细胞中表达位置发生改变，由细胞质更多地进入细胞核，总含量不变。

EMT 在肿瘤诊断、分期和治疗中都有着重要作用。加深对EMT 相关调控因子的研究，不仅有助于更好地理解EMT 发生的机制，而且为了解肿瘤复发与转移的机制提供了新的思路，以EMT 为靶点的抗肿瘤新型药物的研发也将是一个新的研究方向[15]。因此，深入探讨EMT 相关调控因子，可为肿瘤治疗提供新的线索，即通过抑制肿瘤细胞EMT 进程而降低肿瘤细胞的耐药性，可作为肿瘤常规疗法的补充，进而成为一种新的个性化肿瘤治疗方法。