Slug慢病毒表达载体的构建及对ZR75-1细胞上皮间质转化的影响

李华月，刘婕，韩洋，丁丽华，叶棋浓

1.贵州大学 医学院，贵州 贵阳 550025；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100850；3.陆军第81集团军医院，河北 张家口 075000

肿瘤是在多种致癌因子的作用下，由于基因突变，导致细胞增殖失控而发生的，其中上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[1]在肿瘤的发生发展和浸润转移方面起到了至关重要的作用。EMT 是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥重要作用，其主要的特征有细胞黏附分子（如E-钙黏蛋白）表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等[2]。Slug 是转录因子Snail 家族中的锌指蛋白。最初发现，Slug 在背部神经管表达，参与神经胚的形成与神经干的正常发育，在EMT 过程中扮演重要角色[3]。Slug 有高度保守的C2H2 型锌指结构域，可以通过与E-box 结构域结合而抑制靶基因的转录[4]。我们从乳腺cDNA 文库中克隆了Slug 的全长编码序列，构建了Slug 慢病毒真核表达载体，嘌呤霉素筛选得到稳定表达Slug 的ZR75-1 细胞，为进一步检测Slug 在乳腺癌发生、发展过程中对EMT 的影响以及作用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

ZR75-1 乳腺癌细胞、人胚肾293T 细胞、大肠杆菌DH5 和慢病毒pCDH 载体由本实验室保存；DMEM 及小牛血清购于Gibco 公司；转染试剂VigoFect 为威格拉斯生物技术有限公司产品，Megatran 为 Origene 公司产品；LATaq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ购自Ta⁃KaRa 公司；Slug、GAPDH 等抗体购自 Abcam 公司；质粒提取、胶回收和PCR 回收试剂盒均为Pro⁃mega 公司产品；上下游引物由北京赛百盛公司合成；测序由北京博迈得生物技术有限公司完成。

1.2 pCDH-Slug慢病毒表达载体的构建

以乳腺文库为模板，用上游引物（5′-CGGAA TTCGCCACCATGCCGCGCTCCTTCCTG-3′）和 下 游引物（5′-CGGGATCCGTGTGCTACACAGCAGCCA-3′）扩增 Slug 编码基因，采用 1×TaqPCR Mix 酶（反应条件：98℃变性3 min，然后以94℃变性10 s、58℃退火 15 s、72℃延伸 1 min 进行 29 个循环，72℃再延伸4 min）。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，根据目的条带大小回收扩增的DNA 片段。用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切回收的PCR 产物和pCDH表达载体，用胶回收试剂盒回收酶切目的基因和pCDH 载体，使载体和PCR 产物有相同的黏性末端，后用T4DNA 连接酶常温连接4 h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板，培养16～20 h 后挑选阳性克隆，菌液 PCR 鉴定，测序。

1.3 稳定克隆筛选

将293T 细胞接种于6 孔板，接种密度为60%～70%，转染时，将包装质粒VSVG、PAX2 分别与构建的重组质粒pCDH-Slug 和空载体质粒pCDH 混匀于200 μL 无血清无双抗的DMEM 中，分别加入 27 μL Megatran 转染试剂，振荡 10 s 混匀，室温静置10 min 后加入孔中，48 h 后收取病毒液上清，3000 r/min 离心5 min。将包装好的病毒上清加入接种好的ZR75-1 细胞中，6 cm 皿加入4 mL病毒液，24 h 后换液，感染48 h 后每孔加入嘌呤霉素（2 μg/mL），细胞死亡较多时换液，并继续提高嘌呤霉素含量进行筛选，待细胞数量不再减少时即可得到稳定的混合克隆。

1.4 Western印迹检测

收集稳定表达Slug 的ZR75-1 细胞和空载体细胞，用 1×PBS 洗涤 2 次，离心后去上清，加蛋白裂解液（RIPA）冰浴30 min，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸15 min 使蛋白变性，12 000 r/min 离心10 min，取上清液进行SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶常温封闭1～2 h，加入 Slug 抗体（1∶200）、E-钙黏蛋白抗体（1∶200）和 GAPDH 抗体（1∶3000），均 4℃孵育过夜，1×TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，加入 1∶3000 稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG 抗体，室温孵育 1 h，1×TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，化学发光法显影。

1.5 免疫荧光检测

将稳定表达Slug 的ZR75-1 细胞和空载体细胞接种于24 孔板，接种前在24 孔板内放入载玻片，待细胞密度达到40%左右时，移除培养液，用1×PBS 洗 2 次，加入冰甲醇固定 5 min，1×PBS 于摇床洗 3 次，每次 10 min；0.5% Triton-100 溶于 1%的羊血清于冰上放置10 min；1%的羊血清封闭30 min；将玻片细胞面向下倒扣到1%羊血清稀释的E-钙黏蛋白（1∶200）抗体，于湿盒中避光孵育4 h；用1%羊血清洗3 次，每次10 min；加入1%羊血清稀释的 FITC 抗体（1∶1000），室温避光放置 2 h；用 1×PBS 洗 3 次，每次 10 min；DAPI 染色 5 min，1×PBS 洗 2 次，每次 5 min；加 15 μL 防淬灭剂后封片拍照。

1.6 划痕实验

将稳定表达Slug 的ZR75-1 细胞和空载体细胞接种于 6 孔板，每孔细胞数约为 5×105，1 d 后用枪头在六孔板中垂直划下，PBS 洗3 次，加入无血清培养基，37℃、5% CO2培养箱培养，分别于 0、24 h 拍照，记录细胞迁移的位置，用图像软件测量细胞的迁移距离。

1.7 统计学分析

应用SPSS20.0 统计学软件分析，数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增Slug基因

以乳腺文库为模板，PCR 扩增Slug 全长编码序列，获得长度为 750～1000 bp 的 DNA 片段，大小与预期一致（图1）。

2.2 pCDH-Slug表达载体的构建

PCR 扩增的Slug 编码序列和pCDH 载体分别用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，经连接、转化，抗性筛选得到重组质粒，菌液PCR 鉴定为阳性（未显示）者用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，在750～1000 bp 位置可见特异片段，而空载体无此特异条带（图2）。结果表明pCDH-Slug 真核表达载体构建成功。

2.3 pCDH-Slug在293T细胞内的表达鉴定

将上述阳性克隆提取质粒后转染293T 细胞，对照组转染 pCDH 空载体，24 h 后收细胞，West⁃ern 印迹检测细胞内Slug 的表达，以GAPDH 为内参。结果见图3，在相对分子质量32×103处，转染pCDH-Slug 真核表达载体的细胞组明显可见特异性条带，对照组则条带微弱，与预期结果相符，pCDH-Slug 表达载体在293T 细胞中获得表达。

2.4 Slug对ZR75-1乳腺癌细胞形态的影响

图1 PCR 扩增 Slug 基因

图2 重组质粒的双酶切鉴定

图3 pCDH-Slug 在293T 细胞中的表达鉴定

如果上皮细胞发生EMT，细胞形态会改变。镜下观察发现，稳定表达pCDH 的ZR75-1 乳腺癌细胞形态未改变，而稳定表达Slug 的乳腺癌细胞形态变为梭性（图4）。结果说明Slug 可以促进ZR75-1 乳腺癌细胞形态发生改变，发生EMT 化。

2.5 Slug对E-钙黏蛋白表达的影响

将经过嘌呤霉素筛选的稳定表达pCDH 或pCDH-Slug 的ZR75-1 乳腺癌细胞株分别接种于6 cm 皿，待细胞密度为80%～90%时收集细胞，分别用Western 印迹和免疫荧光检测Slug 对E-钙黏蛋白的影响（图5）。Western 印迹显示，与对照组相比，稳定表达Slug 的ZR75-1 乳腺癌细胞中E-钙黏蛋白表达水平明显下降；免疫荧光检测结果与Western 印迹结果一致。结果表明Slug 可以抑制E-钙黏蛋白的表达。

图4 Slug 对ZR75-1 乳腺癌细胞形态的影响

图5 Slug 对E-钙黏蛋白表达的影响

2.6 Slug对ZR75-1乳腺癌细胞迁移的影响

将稳定表达pCDH 或pPCDH-Slug 的ZR75-1乳腺癌细胞接种于六孔板，划痕24 h 后计算细胞迁移距离。结果见图6，Slug 高表达组ZR75-1 细胞的迁移距离明显大于空载体对照组。以上均为3 次独立实验结果的平均值，结果表明Slug 可以促进ZR75-1 乳腺癌细胞迁移。

3 讨论

图6 Slug 对ZR-751 乳腺癌细胞迁移的影响

肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的过程。EMT 是上皮细胞向间质细胞转化的现象，以上皮细胞极性的丧失和间质特性的获得为主要特征[5]，与肿瘤关系密切。E-钙黏蛋白的减少或丢失是EMT 最重要的标志性变化[6]。Slug 是一种具有锌指结构的EMT 转录因子，通过与E-box结构域结合而抑制E-钙黏蛋白转录，诱导EMT的发生。E-钙黏蛋白广泛分布于胚胎组织和成熟组织的上皮细胞中，除具有调节胚胎组织的发育、组织形成、参与细胞与细胞间信息传递交流等作用外，对促进细胞的黏附聚集、维持上皮形态结构的完整性、维持细胞极性和参与分化调节也至关重要[8]。我们构建了Slug 慢病毒表达载体pCDH-Slug，发现 Slug 可以促使 ZR-751 乳腺癌细胞形态发生改变，还可以降低E-钙黏蛋白的表达。E-钙黏蛋白作为细胞黏附分子家族中的一员，与肿瘤的转移和浸润密切相关[7]。因此，我们推断Slug 可能通过调节E-钙黏蛋白的表达，从而影响乳腺癌细胞的浸润、迁移。本研究为进一步探讨Slug 在肿瘤发生发展中的作用机制开辟了新的方向，也为临床分子靶向治疗奠定了基础。