黔中地区马尾松林下杜鹃根部内生真菌群落组成及其生态功能

熊 丹,欧 静,*,李林盼,杨舒婷,何跃军,李朝婵

1 贵州大学林学院, 贵阳 550025 2 贵州师范大学贵州省山地环境重点实验室, 贵阳 550001

真菌多样性是生物多样性的重要组成部分,主要包括形态多样性、物种多样性和功能多样性,有研究表明菌根真菌能提高苗木移栽成活率,研究其多样性可以为荒山改造、水土保持、增加森林覆盖率等做贡献,因而具有重大意义[1- 2]。杜鹃(Rhododendronsimsii)生于海拔500—1200(-2500)m的山地疏灌丛或松林下[3],素有“花中此物最西施”的美誉,具有重要的观赏价值和园林应用价值[4]。植物与土壤中的真菌互作形成根系共生体(Root-associated fungi, RAF)[5],真菌通过分解有机物质为宿主植物提供必须的营养[6- 7],可促进种子的萌发[8]、营养物质的吸收[9]、幼苗的生长与发育[10],增加对水分胁迫的耐受性和光合效率,进而提高其对恶劣生境的适应能力[11- 12]。杜鹃属植物具有丰富的真菌多样性[13- 14],Heinonsalo等[15]对同一生境下的杜鹃属植物菌根(Ericoid mycorrhizal fungi,ERM)及伴生植物菌根进行比较研究,得出ERM在其他植物根部也能形成,共生植物菌根之间存在关联性。以往对ERM的研究多从分离鉴定其菌根菌后回接到宿主植物,通过观察其对宿主生理生态的影响分析其功能性,故而忽略了杜鹃根部不能分离的未知真菌类群,分离真菌回接到宿主具有随机性和盲目性,工作量大且研究周期长。相关报道发现直接分子检测法能较为全面地反映杜鹃属植物RAF多样性[16],FUNGuild 注释软件可不依赖于培养的分子检测技术,根据不同类型真菌能以相似方式利用相同类型营养物质为划分依据,借助生态功能群从分类学上解析真菌的生态类型[17],近年来以 Venn 图中重叠的圆圈部分表示核心微生物组为微生物群落的研究提供了新的思路[18- 19],而鲜有关于马尾松林下杜鹃RAF群落组成和生态功能结构分析的报道,其核心基因组真菌研究更是罕见。

本文基于高通量测序技术,从真菌分类学和功能多样性角度对黔中3个地区马尾松林下杜鹃根内生真菌进行多样性分析,在系统了解菌群结构组成的基础上对真菌功能多样性进行深入探讨,分析生活在马尾松林下的杜鹃根内生菌中是否存在具标记性的核心真菌组(core microbiome) 及关键物种(keystone species),并以网络图的形式展现不同菌群之间的相关性,初步探讨了黔中三个地区杜鹃根部真菌的群落组成及生态功能群二者间的联系,有助于揭示宿主植物的环境适应性机制,为今后开展杜鹃菌根真菌在杜鹃人工繁育中的应用奠定基础,同时为园林上将杜鹃与马尾松配植提供数据参考。

1 研究方法

1.1 研究地概况

选取黔中贵阳市花溪区孟关乡(N26.840, E106.989,海拔1270m)、乌当区百宜镇拐比村(N26.415, E106.749,海拔1196m)和贵州省黔南龙里县龙架山森林公园(N26.465, E106.937,海拔1182m)为试验样地。研究区植物群落从上到下依次为乔木层、灌木层、草本层。其中马尾松-杜鹃为样地常见植物群落,马尾松树高15—20 m,胸径25—35 cm；杜鹃高1.75—2.40 m,地径2.5—3.2 cm。此外,样地伴生植物为：白栎(QuercusfabriHance)、茅栗(CastaneaseguiniiDode)等多种灌木。黔中地区属亚热带季风性湿润气候,土壤以山地黄壤为主,呈酸性,土质粘重。年均温约15.3 ℃,年降雨量高于870 mm,平均相对空气湿度79.9%,日照百分率25.7%,无霜期200 d以上。

1.2 试验方法

1.2.1样品采集

于2017年5月15日、17日、20日分别在贵州省黔南龙里龙架山森林公园(LL),贵阳市乌当区百宜镇拐比村(WD)、花溪区孟关乡(MG)选取马尾松-杜鹃生长良好且杜鹃长势相似的群落,在不破坏生态环境的情况下,去除杜鹃垂直盖度以下的枯枝落叶层和杂物,由主干追踪到侧根和发根区域,挖出5—20 cm的杜鹃根段主要分布层,剪取粗壮发根(直径0.5—1.5mm,样品0.5g)用作杜鹃根部真菌群落组成分析,取样后覆土。每个地区选择三个样方采集3个样品,每个样品之间间隔超过5 m,试验一共9个样品。试验工具在采样之前均经过严格灭菌处理,样本采集后立刻用液氮处理,带回后保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2根样中真菌基因组DNA提取、扩增及测序

采用Illumina MiSeq二代测序平台对样本DNA片段进行双端(Paired-end)测序(由上海派森诺生物测序公司完成)。利用试剂盒omega EZNA soil extration kit提取杜鹃菌根真菌DNA,操作步骤如下：

(1)将预处理好的根样放到对应编号且预装有500mg glassbeads的2mL离心管中；

(2)向上述样品管中加入0.8mL Buffer SLX Mlus.于组织破碎仪25HZ振荡7min；

(3)加入80μL Buffer DS,振荡混匀；

(4) 90℃孵育10min,孵育期间颠倒离心管以混匀其中液体1—2次(因不知样品中是否含有难裂解的真菌,故将孵育温度提高至90℃)；

(5)13000×g(12000rpm)室温离心5min,转移600μL上清至新的96深孔板中,加入200μL Buffer SP2,用手轻轻振荡混匀,加入100μL HTR Reagent；

(6)冰浴5min,4000×g(3700rpm)离心10min；

(7)转移上清400μL至96深孔板中,加入40μL磁珠,450μL Binding Buffer,混匀,室温放置2min；

(8)上核酸纯化仪进行纯化。

利用0.8% 的凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度。检测合格后,利用真菌rDNA-ITS保守区上游引物：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3′和下游引物：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3′[20],进行特异性扩增,PCR反应程序为：98 ℃预热变性2 min；25个循环,每个循环98 ℃,热变性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s；最后72 ℃ 延伸5 min,10 ℃保存。将扩增产物进行回收、荧光定量,回收采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库,文库制备合格后上机测序,测序得到的基因序列提交至GenBank数据库。登录号PRJNA505090,编号为SAMN10386261-SAMN10386263,SAMN10386267-SAMN10386269,SAMN10386273-SAMN10386275。

获得原始数据后,对测序质量进行评估和质控,利用QIIME软件将分类单元OTU (Operational Taxonomic Units)归并和聚类(相似度阈值为97%)[21],采用UNITE数据库[22]进行OTU分类注释；获得OTU丰度矩阵之后,计算每个样本真菌群落的Alpha多样性。

1.2.3杜鹃根内生真菌多样性检测和功能分析

生态功能群分析：选取菌群丰度大于10的OTU序列,采用FUNGuild在线数据库平台(https://github.-com/UMNFuN/ FUNGuild)[17],将杜鹃根部内生菌划到不同的营养型(Trophic mode)和共位群(Guild)。营养型包括共生型(Symbiotroph)、腐生型(Saprotroph)、病原型(Pathotroph)；共位群包括杜鹃菌根真菌、外生菌根真菌、丛枝菌根真菌、兰科植物菌根真菌、内生真菌、病原真菌、腐生真菌等[23- 24]。

关联网络图分析：根据真菌在各样本中的分布,选取丰度大于20的物种,调用R语言vegan、Igraph、psych、pheatmap、magrittr、ggplot2、RColorBrewer、reshape2、cluster包,对菌群进行关联网络图分析。

2 结果

2.1 杜鹃根内生真菌的群落结构

图1 共有分类单元(OTU)的Venn图Fig.1 Venn diagrams of OTU

通过高通量测序方法对黔中乌当(WD)、孟关(MG)、龙里(LL)三个地区的杜鹃根内生真菌群落组成分析,共获得有效序列425799条,按照97%的相似阈值对有效序列进行聚类,共获得817个OTU,韦恩图(图1)显示,MG真菌OTU总数441,WD为449,LL为433,共有真菌OTU数143,表明三个地区杜鹃根部内生菌OTU值数量差异较小。

经聚类,817个OTU分属于8门、18纲、53目、105科、152属,优势菌群系为子囊菌门(81.2%)、接合菌门(5.8%)、担子菌门(4.7%)；优势菌纲主要为散囊菌纲(43.0%)、粪壳菌纲(18.9%)、锤舌菌纲(7.0%)等；优势菌目为散囊菌目(39.2%)、肉座菌目(9.1%)、Xylariales(8.4%)、柔膜菌目(6.1%)等；优势科有发菌科(39.2%) 、圆孔壳科(8.4%)、肉座菌科(7.2%)等；152属中相对丰度大于0.01%的真菌共有30个属,主要是青霉属(38.60%) 、木霉属(7.20%)、拟盘多毛孢属(6.10%)、Umbelopsis4.40%等(见图2)。

图2 杜鹃根内生真菌群系组成Fig.2 Composition of endophytic fungi in roots of Rhododendron simsii

2.2 不同区系优势菌群

孟关(MG)地区杜鹃根内生优势真菌为子囊菌门Ascomycota的青霉菌属Penicillium、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis、木霉属Trichoderma、新拟水蚤属Neopestalotiopsis和一未知属,接合菌门Zygomycota伞状霉属Umbelopsis,担子菌门Basidiomycota隐球菌属Cryptococcus；乌当(WD)地区优势真菌组成为子囊菌门的青霉菌属、Hydropunctaria、木霉属、Chloridium、Neopestalotiopsis、隐球菌属Cryptococcus,接合菌门的Umbelopsis；龙里(LL)地区的优势真菌子囊菌门的青霉菌属、拟盘多毛孢属、木霉属、Archaeorhizomyces、Phialocephala、Chloridium、Neopestalotiopsis、Cryptococcus,接合菌门的Umbelopsis,担子菌门伞菌纲Agaricomycetes的未定属。三个地区杜鹃根部真菌具有较高的多样性,真菌之间既有相似又有差异,其中包括了典型的ERM树粉孢属Oidiodendron(0.4%),ECM红菇属Russula(0.2%)、乳菇属Lactarius(0.2%)及其他类型的菌根菌。而丰度最高的是青霉菌属、木霉属和拟盘多毛孢属,在杜鹃根部均有分布,表现出一定的寄主专一性。杜鹃根部内生真菌类型丰富,但杜鹃类菌根菌(ERM)占比相对较低。

2.3 真菌的Alpha多样性

通过R软件,对属水平的真菌群落组成结构进行PCA分析,第一和第二主轴的累积方差贡献率为83.46%,其中第一主轴解释真菌属水平组成方差变异的72.58%,第二主轴解释10.88%,不同地区之间菌群组成差异较大(图3)。3 个样地的 α 多样性指数见表1,Simpson指数、Shannon指数LL>WD>MG,LL Simpson指数显著高于MG(P<0.05),LL与WD、WD与MG之间不存在显著差异,而Shannon指数WD、LL显著高于MG(P<0.05),WD、LL之间不存在显著差异。ACE指数、Chao1指数WD>MG>LL,Chao1指数WD显著高于MG和LL(P<0.05),MG和LL不存在显著差异。可见,WD地区真菌多样性最大,丰富度也最高,LL地区真菌多样性次之,MG丰富度略高于LL,但不存在显著差异。马尾松林下杜鹃根部内生真菌OTU数量差异值较小,但组成上存在较大差异。

图3 属水平的群落组成结构PCA分析Fig.3 PCA analysis of community composition at genus level

表1 杜鹃根内生真菌Alpha多样性指数表

同列数据后不同大写字母表示差异显著(P<0.05)

2.4 杜鹃根内生菌的生态功能分析

基于FUNGuild软件解析结果显示(表2),除未知菌群外杜鹃根内生真菌主要分为10个生态功能群,分别是未定义腐生菌Undefined Saprotroph (194 OTU)、植物病原菌Plant Pathogen (20 OTU)、土壤腐生菌Soil Saprotroph (18 OTU)、外生菌Ectomycorrhizal (14 OTU)、地衣共生真菌Lichenized fungi (10 OTU)、杜鹃类菌根真菌Ericoid Mycorrhizal (5 OTU)、木腐生菌Wood Saprotroph (5 OTU)、丛枝菌根Arbuscular Mycorrhizal (4 OTU)、内生菌Endophyte (2 OTU)和动物病原菌Animal Pathogen (8 OTU) 10类。此外还有多种混合营养型的真菌如：寄生性真菌-不定腐生菌Fungal Parasite-Undefined Saprotroph (11 OTU)；植物病原-土壤腐生-木材腐生菌Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph (8 OTU)；植物内生-病原菌Endophyte-Plant Pathogen (2 OTU)等21类,102个Undefined种类在FUNGuild数据库中没有参考信息。

2.5 根内生真菌核心真菌组及关键物种分析

不同类型的真菌行使不同的功能,推测存在着重要的功能菌群,为此,采用R语言对杜鹃根部内生菌功能群做关联网络分析,获得的有效功能类别关联图结构为8大部分,包含265个真菌OTU,3357条关系,不同颜色代表不同关联性的菌群,OTU所在网络图中的圆球越大,则竞争能力越大,之间的连线越粗代表影响力和关联性也越高(图3)。结合三个地区杜鹃根内生共有真菌Venn图发现,共有属中有19个分类单元 otu在共有功能群中分布频率较高,分别是otu3717青霉属(Penicillium)、otu1062木霉属(Trichoderma)、otu0青霉属(Penicillium)、otu1580拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、otu2468(Chloridium)、隐球菌属(Cryptococcus)、otu108银耳目(Tremellales)、otu807(Hydropunctaria)、otu2049毛孢子菌属(Trichosporon)、otu2592树粉孢属(Oidiodendron)、otu2115短梗霉属(Aureobasidium)、otu376短梗霉属(Aureobasidium)、otu1537(Phialocephala)、otu3296支顶孢属(Acremonium)、otu3433假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)、otu1800(Purpureocillium)、otu2492腐质霉属(Humicola)、otu1787(unidentified)、otu313(unidentified)。这些核心真菌在不同地区的杜鹃根部均有出现,其生态类型见表2,从功能网络图分析看出,不同生态型真菌之间存在关联性,根部真菌可以形成生态位共享模式,而且不同功能群之间存在耦合性,功能大小不一。功能团之间包含有多种类型的菌群结构,在时间和空间上相互联系,推测这是多个OTU在微生物组内功能冗余的表现形式,核心基因组与关键物种以真菌组形成的生态功能团表现。

表2 杜鹃根内生真菌功能解析

图4 杜鹃根内生真菌OTU生态功能群的共存网络图Fig.4 Coexistence Network of Endophytic Fungi OTU in Rhododendron simsii RootsAnimal pat和Plant pat 表示动物病原菌和植物病原菌,Und.sap 表示未知腐生菌 (图中只显示部分OTU名称)

3 讨论

3.1 杜鹃根内生真菌的群落多样性

根部真菌(RAF)多样性决定了植物的多样性、生态系统的变异性和生产量[25]。高通量测序获得杜鹃根内生真菌DNA序列425799条,聚类后得到的817个OTU分属于8门、18纲、53目、105科、152属。主要隶属于子囊菌门(81.2%)、接合菌门(5.8%)和担子菌门(4.7%)；优势纲、目、科分别为：散囊菌纲(43.0%)、散囊菌目(39.2%)、发菌科(39.2%)；在属的水平上,青霉属(38.60%)占比最高,其次是木霉属(7.20%)、拟盘多毛孢属(6.10%)。

杜鹃RAF中有典型的树粉孢属Oidiodendron(ERM),红菇属Russula(ECM)、乳菇属Lactarius及其他类型的菌根菌。研究发现的杜鹃RAF已有大量报道,如青霉属、红菇属、蜡壳耳属、隐球菌属等在不同林型马银花(R.ovatum)根部均有分布[26],台湾杜鹃(R.formosan)[7]、树枫杜鹃(R.changii)和云南大理灰背杜鹃(R.hippophaeoides)[27]菌根中均有隐球菌属。不同生态类型的菌根真菌在杜鹃根部共生,其形成原因可能是共生植物之间菌根存在着关联性,马尾松林中不同植物地下部分菌根能形成关联网络。子囊菌门柔膜菌目和担子菌门蜡壳耳目是典型的杜鹃花类植物菌根菌,张春英等[14]、刘仁阳等[28]也分别从云锦杜鹃(R.fortunei)和雷山杜鹃(R.leishanicum)根中分离到此类真菌。相比于黄彩微等[16]从薄叶马银花(R.leptothrium)根系检测到的8个OTU 和锈红杜鹃(R.bureavii)根系的7个OTU,黔中马尾松林下生长的杜鹃根内生真菌丰富度和多样性极高,OTU数量大于来自于我国长白山(355 OTU)、大兴安岭(229 OTU)和小兴安岭(226 OTU)地区的越桔(Vacciniumuliginosum)[29]根部真菌。Alpha多样性分析显示, WD地区真菌多样性最大,丰富度也最高,LL地区真菌多样性次之,MG丰富度略高于LL,但不存在差异显著。导致这一现象的原因可能是受杜鹃自身生长周期与生境因素的影响,三个区系杜鹃处于不同小生境下,内生真菌菌群的分布及组成也会有所不同。植物内生真菌菌群在宿主植物中的组成及生态分布特征往往会随着宿主树龄、组织类型、营养成分、生长季节、温度升降、降水量多寡等众多因素的变化而变化[30- 31]。受植物种、植物群落和环境因子的相互作用,植物组成接近的生态群落,其环境因子组成上也比较接近,但生境差异促进了菌群数量和结构的多样化[32]。笔者所在课题组已对黔中不同片区马尾松林植物多样性和杜鹃根部土壤的理化性质进行分析,探讨植物多样性和土壤理化性质对马尾松-杜鹃混交林真菌群落结构的影响(论文待发表)。

3.2 根内生真菌的生态功能多样性

菌群中真菌的群落组成对宿主和环境的影响一直是该领域的热点,微生物群落组成和丰度对生态系统有重要的调节功能,核心真菌组与关键物种的贡献也成为研究的重要部分。FUNGuild 软件解析菌群结果显示,otu2592、otu3579、otu323、otu106、otu1936同属于ERM,生长形态学(Growth Morphology)属于黑色有隔内生菌(Dark Separate Endophytes, DSE),DSE广泛存在于高山和极地的植物根部,能增强植物对P的吸收和获取[16,33]。外生菌根(Ectomycorrhizal,ECM)功能群包含有otu2468、otu912、otu2287等14个OTU,它 们 分 别 是Chloridium、Russula、Lactarius等[34],ECM多为子囊菌门和担子菌门真菌,能够在温带和热带生态系统中与广泛的宿主建立共生关系,常与松科(Pinaceae)、桦木科(Betulaceae)、豆科(Fabaceae)、龙脑香科(Dipterocarpaceae)、壳斗科(Fagaceae)和桃金娘科(Myrtaceae)等高等植物形成菌根[35- 36]。以子囊菌门为主的腐生型真菌在杜鹃RAF群落中也较常见,如未定义腐生菌群(Undefined Saprotroph 194 OTU),其中otu3717、otu0、otu1062分别是Penicilliumabidjanum,Penicilliumspinulosum,Trichodermaatroviride,这三类真菌出现在有云杉属(Picea)、欧洲赤松(PinussylvestrisL.)和杜鹃属(RhododendronL.)共生的瑞典中部混交林中,反映了真菌多样性与宿主的相关性[37]。土壤腐生菌(Soil Saprotroph)功能群中包含有otu242、otu371、otu590等18个菌群,它们都是古生菌Archaeorhizomycetaceae,普遍存在于松属、杜鹃属和其他阔叶树的根和根际土壤中,对宿主选择具有专一性并具腐生潜力,其形成的菌根包括数百种复杂且不可识别的丝状结构,在热带潮湿森林中具有丰富的多样性[38]。

与Nguyen等[17]结论相似,FUNGuild数据库解析不全面,还需补充完善,Undefined包含otu1787、otu313、otu396等102个OTU,此类真菌在属水平上分类地位未定,需要进一步探索其真菌资源。本研究中杜鹃为马尾松林下伴生植物,数据分析显示其根部内生真菌功能群分类达到32个,传统的ERM真菌在杜鹃中所占比例不大,而未定义腐生菌群(Undefined Saprotroph)占比最高。研究发现,一些 OTU无法在属水平上被解析到定义的功能群中；而另一方面被定义的 OTU 则又属于各种功能群中,FUNGuild主要是基于营养型来对真菌进行功能划分的,但有的真菌不仅只有一种营养方式,他们在生活史的不同阶段变换着营养方式适应环境的改变,所以才有多样的功能营养型。如本研究中,植物病原-土壤腐生-木材腐生菌功能群(Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph)的8个OTU均为Fusarium,既是腐生菌也是内生菌或植物病原菌。植物内生真菌在植物的不同生活周期中扮演不同的角色,在发育学上处于不稳定的阶段,在植物组织健康生长的时候是内生真菌,但当组织衰老或死亡时它们是腐生真菌,这些具复杂生活史的真菌为应对不同的生存条件而可采取了不同的生存策略[39- 40]。此外,杜鹃根部内生菌中生活着动物病原菌(Animal Pathogen)功能群,Baarlen等[41]把这一现象解释为一些病原微生物能够侵染不同生物寄主,在自然界跨界侵染人与动物。RAF可以形成促进、拮抗或竞争的地下生态模式,以及真菌之间的生态位共享[24]。植物内生真菌与宿主植物之间往往是一种动态平衡的协同关系,菌群的群落组成对宿主植物多样性及生态环境稳定性起着巨大的影响,菌群组成丰度保证了生态功能系统正常运行,其多样性增加生态系统对外界环境抵抗性,具有非常重要的生态功能[42- 43]。有研究表明,生物多样性越高,在新的环境条件下,部分多余的生物体可以承担这种功能的可能性就越高,即生物多样性的保险效应[44]。因此,与地上生物多样性类似,真菌多样性可能会对环境变化下的生态系统稳定性产生直接影响[45],共生植物之间菌根存在着关联性,增加了森林生态系统的生物多样性和生态稳定性,核心基因组与关键物种的存在说明了真菌与宿主之间的相互选择关系。菌群功能团包含有多种类型的真菌,在时间和空间上相互联系,推测这是多个OTU在微生物组内功能冗余的表现形式,核心基因组与关键物种以真菌组形成的生态功能团而表现。

4 结论

黔中马尾松林下杜鹃根部拥有丰富的菌根类群,除了传统的ERM菌根类型外,还有ECM、AM、ENM等多种类型菌根,生态功能群丰富,其中乌当(WD)地区杜鹃菌根真菌多样性最大,丰富度也最高。这些功能复杂的菌群耦合,增加了森林生态系统的生物多样性和生态稳定性,而核心基因组与关键物种只能以真菌组形成的生态功能团表现,这些核心真菌类群值得进一步研究其生态意义。