蛋白激酶抑制剂B对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响

张丹凤 李晶 于海波 窦鹏挥 肖晓超 薛晴

(佳木斯大学 1附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154007；2基础医学院；3佳木斯市妇幼保健院；4佳木斯大学临床医学院)

卵巢癌为妇科肿瘤首位的三大恶性肿瘤之一，据统计，每年全世界大约新发病例23.9万〔1〕，死亡患者超出15万人次〔2〕，5年生存率只有30%〔3〕。通常其发生发展可能与相关肿瘤蛋白刺激卵巢上皮细胞增殖、异常分裂及细胞因子的改变有关。作为蛋白激酶抑制剂(PKI)家族中新的耐热蛋白PKIB，与多数肿瘤关系紧密，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌等，特别是其在乳腺癌细胞增殖中发挥效应。目前PKIB低表达对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移影响的研究报道较少。本研究分析PKIB低表达对卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1细胞来源 卵巢癌细胞株A2780细胞购于美国菌种保藏中心(ATCC)。用MCCOY 5A和 RPIM1640 完全培养基培养，37℃，5% CO2培养，培养基更换时间依细胞状态来确定(每天或隔天)，实验取对数期生长较好的细胞(形态、形状、期别等)。

1.2细胞转染 将A2780细胞悬液种于6孔板中，融合度为70%～90%且需细胞贴壁。每孔的转染试剂混合液为质粒2 μg(siRNA 15 μl)+转染试剂6 μl+无血清无双抗RPMI1640 200 μl。静置20 min于冰上。先逐孔丢弃细胞原培养液，后加入200 μl转染试剂混合液及培养基1.3 ml(含10%血清的RPMI1640)。需轻摇动混匀，培养在培养箱中(环境37℃、含5%CO2)。72 h后取总蛋白备用。

1.3试剂 PKIB抗体购于美国 Abcam(Cambridge，MA，USA)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自DAKO，免疫组化抗原修复液乙二胺四乙酸(EDTA)购自中杉金桥生物公司，山羊血清封闭液购自北京博奥森生物技术有限公司，磷酸盐缓冲液(PBS)、焦碳酸二乙酸(DEPC)试剂购自武汉博士德生物技术有限公司，ABI PRISM 7500 Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA)，高速低温冷冻离心机购自Heraeus，光学显微镜购自奥林巴斯公司。

1.4CCK-8 细胞生长实验 把转染后的细胞进行常规消化、离心、重悬、计数，在 96 孔板内行细胞接种(1 000个/孔)，需设 4 个复孔处理每组细胞后在培养箱内孵育细胞。10%CCK-8滴加时间是6 h、第 1、2、3、4、5 天，孵育2 h(避光、37℃)，测 450 nm的吸光度(OD)值(用酶标仪操作)。重复操作3次上述实验。

1.5细胞侵袭能力检测 采用Matrigel小室进行，人卵巢癌细胞接种到上室以1×104/孔的密度，下室接种巨噬细胞以 1×104/ 孔的密度。培养3 d，取出小室滤膜下表面的细胞，离心后重悬于100 μl的PBS，甩片。先行细胞涂片干燥、染色，侵袭细胞数量用荧光显微镜观察和计数。

1.6细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力 细胞密度要求5×108/L，用6孔板接种，在温箱孵育过夜(5%CO2)，细胞汇合度要达到100%。记号笔在每个孔的背面做好划痕标记，便于数据获取时保持位置一致。垂直于标记线快速进行划痕采用无菌枪头。反复冲洗细胞孔以去除悬浮细胞(用PBS)。在37℃、5%CO2条件下孵育，前提是在培养孔内加入不含血清的DMEM培养基。取样依据时间设计点，显微镜下拍照，先测定划痕的初始距离(0 h)；按照时间设定要求依次测定划痕距离并拍照储存后计算细胞迁移率，重复3次上述实验过程。

1.7统计学分析 应用SPSS15.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1PKIB对卵巢癌细胞增殖的影响 PKIB shRNA组24、48、72 h细胞增殖能力明显高于NC组(P<0.05)，见表1。

表1 两组培养不同时间后细胞增殖能力值，n=4)

与NC组比较：1)P<0.05

2.2侵袭能力检测 PKIB shRNA组侵袭穿膜细胞数〔(101+27)个〕明显高于NC组〔(47+12)个〕(P<0.05)。见图1。

2.3迁移能力测定 PKIB shRNA组迁移能力明显加强，48 h迁移率为67.9%，而NC组48 h迁移率为43.1%，组间差异显著(P<0.05)，见图2。

图1 两组A2780细胞侵袭(×200)

图2 两组细胞迁移(×40)

3 讨 论

一般情况下，肿瘤患者有自觉症状发现大多数已是晚期，治疗难度增加，再加之化疗产生的耐药及出现的转移和复发〔4〕，对患者身心带来莫大的伤害和压力〔5～7〕。由于肿瘤的转移增加了患者死亡的概率，而这种转移和侵袭性又受到很多因素、大量基因控制和影响〔8～10〕。鉴于以上原因，目前临床治疗的关键就在于探究卵巢癌的转移和分子机制，进而实施基因靶向治疗〔11〕。现今RNA干扰技术是研究的热点〔12〕，其有益之处在于特异性强、可同时抑制多个基因且疗效明显，具有广阔的应用前景和临床价值〔13,14〕。

与肿瘤发生、发展密切相关的还包括肿瘤微环境中炎性因子〔15〕。作为由78个氨基酸残基组成的PKI家族的成员之一的新型耐热蛋白PKIB，最早是从兔睾丸中分离得到，有学者证实在大鼠和人组织中也存在该蛋白〔16〕。通常，大多数肿瘤的生物学行为都与PKIB有关。本研究结果显示：PKIB 低表达可加强细胞的增殖，由此证明PKIB 参与卵巢癌细胞的增殖并且起促进作用。通常侵袭和转移也是癌症患者死亡的一个主要原因。本实验表明PKIB表达对卵巢腺癌细胞的侵袭起重要作用。PKIB 低表达增强卵巢癌细胞侵袭和迁移能力。PKIB 作为原癌基因参与调节卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移，但其作用机制和相关信号转导通路的确定还需进一步研究。