miR-302b-3p靶向AKT1调节皮肤成纤维细胞衰老的作用机制

杨心妮 鲁晴 张鑫 贺锦桥 梁伟兵 黄高翔 苏晓雪 黎静

(广西医科大学 1基础医学院生理学教研室，广西 南宁 530021；2第八附属医院3D打印中心)

皮肤是人体最大的器官，随着人体年龄的增长，皮肤也像其他器官一样功能减弱并引起各种病变，逐渐出现皮肤老化状态。miRNAs参与调节机体的多种功能，在皮肤衰老的过程中扮演重要角色。本研究将探讨miR-302b-3p靶向丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)1基因表达调节皮肤成纤维细胞衰老的分子机制。

1 材料和方法

1.1复制性细胞衰老模型的建立 采用酶消化法，将5～7 d的昆明乳鼠(广西医科大学动物实验中心提供)背部皮肤组织剪成小块，用0.1%Ⅰ型胶原酶消化1.5 h，离心收集细胞加入含15%胎牛血清的高糖DMEM培养液置于培养瓶中培养。分别取连续培养第2代(P=2)及第15代(P=15)的皮肤成纤维细胞，第2代(P=2)作为对照组细胞，第15代(P=15)作为自然衰老组细胞。

1.2Real-time PCR检测miR-302b-3p的表达 各组细胞按照Trizol试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA，采用紫外分光光度计测A260/A280，比值处于1.8～2.1之间。按照miRNA第一链cDNA合成试剂盒〔生工生物工程(上海)公司〕说明书操作，逆转录合成cDNA，cDNA 1∶10稀释后，进行realtime PCR分析，每样本3个重复，PCR步骤：95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。以U6为miRNA内参标准，mmu-miR-302b-3p上游引物由生工生物工程(上海)公司合成，其序列为：GCGGTAAGTGCTTCCATGTTTTAGTAG。

1.3细胞转染及转染效率检测 将皮肤成纤维细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基的6孔板中，接种的细胞数约为5×105/孔。次日细胞汇合度达到70%～80%时，按照Lipofectamine RNA imax 的说明书操作，分别给予细胞转染NC、模拟物(mimic)及抑制剂(inhibitor)。继续培养48 h进行后续实验。

1.4RT-PCR法检测靶基因 提取各组细胞总RNA，紫外线分光光度仪测定吸光度，并计算RNA含量。取2 μg RNA采用逆转录酶(AMV)进行逆转录合成cDNA后，采用SYBR Green荧光染料进行PCR扩增，每组3个复孔。PCR反应步骤：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 1 min，共40个循环。引物序列为：GAPDH上游引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；下游：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′；AKT1上游：5′-TGTGAAGGAGGGTTGGCTGC-3′，下游：5′-ACTGCGCCACAGAGAAGTTGTT-3′。

1.5Western印迹法分析AKT1蛋白表达情况 各组细胞转染48 h后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，每孔加入蛋白裂解液后，反复吹打，使细胞充分裂解，95～100℃煮沸10 min，10 000 r/min离心10 min，收集的上清液即为样本蛋白。顺序加样，待电泳分离完全后，采用湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，TBST充分洗膜后加入特异性一抗β-actin(1∶10 000 稀释)及AKT1(1∶1 000稀释) 。4℃过夜孵育，二抗(1∶10 000稀释)室温孵育1 h，充分洗膜后加电化学发光(ECL)液显影，凝胶成像仪自动曝光，并分析灰度值，每个样本重复3次。

1.6统计学分析 采用SPSS11.5 软件进行独立样本t检验。

2 结 果

2.1miR-302b-3p在复制性衰老细胞中的表达情况 与对照组相比，衰老组细胞中miR-302b-3p的表达显著上调，差异有统计学意义(1.00±0.00 vs 5.27±0.41,P<0.01)。

2.2miR-302b-3p mimic及inhibitor 转染后细胞miR-302b-3p的表达 与NC组(1.00±0.00)比较，miR-302b-3p mimic干预后细胞中miR-302b-3p表达显著升高，差异有统计学意义(88.92±20.53，P<0.01)；miR-302b-3p inhibitor干预后细胞中miR-302b-3p表达显著降低，差异有统计学意义(0.53±0.17，P<0.05)。

2.3miR-302b-3p促进皮肤成纤维细胞的衰老 与NC组〔(4.20±0.83)%〕比较，miR-302b-3p mimic转染后皮肤成纤维细胞衰老染色阳性细胞数目显著增加〔(10.80±2.58)%,P<0.05〕；反之，miR-302b-3p inhibitor转染后皮肤成纤维细胞衰老染色阳性细胞数目无明显增加〔(4.00±1.58)%,P>0.05〕。见图1。

2.4miR-302b-3p的靶基因预测 通过生物信息学软件Targetscan对miR-302b-3p靶基因进行预测分析。分析结果表明miR-302b-3p可与AKT1的3′-UTR靶向结合。见图2。提示AKT1是miR-302b-3p的预测靶基因。

2.5miR-302b-3p对靶基因AKT1 mRNA的调节作用 与NC组(1.00±0.00)比较，miR-302b-3p mimic干预后细胞中AKT1 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义(0.58±0.12，P<0.05)；miR-302b-3p inhibitor干预后细胞中AKT1 mRNA表达显著升高，差异有统计学意义(2.03±0.42，P<0.01)。

2.6miR-302b-3p对AKT1蛋白表达的影响 NC组，miR-302b-3p mimic 200 nmol/L、100 nmol/L、50 nmol/L组，miR-302b-3p inhibitor 100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L组AKT1蛋白表达量分别为：29.61±1.57、7.16±1.01、12.04±1.19、10.01±1.04、11.04±0.87、21.15±1.21、40.12±1.71。当皮肤成纤维细胞上调miR-302b-3p的表达时，AKT1蛋白表达显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)，而且呈现一定的剂量依赖性。当皮肤成纤维细胞下调miR-302b-3p的表达时，AKT1的蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，而且呈现一定的剂量依赖性。见图3。

图1 miR-302b-3p干预后皮肤成纤维细胞衰老染色情况(×100)

图2 TARGETSCAN预测miR-302b-3p与靶基因的靶向结合示意图

1～3:miR-302b-3p mimic 200、100、50 nmol/L组；3～6：miR-302b-3p inhibitor 100、200、300 nmol/L组；7：NC组

3 讨 论

衰老是指随着时间的推移个体发生功能性和器质性衰退的渐进过程。皮肤衰老在细胞、分子水平可表现为染色体端粒缩短、DNA甲基化水平下降、EGF等生长因子及其受体减少，进而使皮肤细胞增殖分化能力减弱、新陈代谢减缓等〔1〕。miRNAs 是长度约为22 nt单链的非编码小分子RNA，miRNA虽然不具有编码功能，但是能在转录后起作用调控基因的表达。miRNAs可参与许多主要的细胞生物学过程，如机体生长、发育、增殖与分化、能量代谢、衰老、炎症反应等，它通过直接结合mRNA而抑制翻译或者直接降解mRNA阻碍翻译〔2〕，从而参与细胞的多种生理和病理过程，如细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤形成等〔3.4〕。因此，miRNAs能通过多种途径影响机体的衰老过程〔5〕。

miR-302b-3p在胚胎干细胞中首次发现具有调节自我更新和增殖特性等功能〔6〕。在人子宫内膜癌细胞中，miR-302b-3p的过表达通过抑制B细胞淋巴瘤(BCL)-2的表达水平，增加BCL-2 相关蛋白(BA)XmRNA和蛋白水平的表达，从而加速细胞凋亡〔7〕。本研究证实miR-302b-3p在复制性细胞衰老中表达显著升高，而且能够显著促进皮肤成纤维细胞的衰老，进一步提示miR-302b-3p可能是调节皮肤成纤维细胞衰老的重要miRNA。

AKT信号转导通路是调控衰老的重要信号通路之一〔8,9〕。细胞衰老过程中，能够通过磷脂酰肌醇-3-激酸酶(PI3K)信号通路的激活来提高氧化应激产物活性氧(ROS)的堆积从而影响人皮肤成纤维细胞的衰老〔10〕。有研究表明PI3K-AKT/mTOR 信号通路能够调控人血管内皮细胞的复制性衰老〔11〕。miR-30b可通过抑制AKT1的表达调控干细胞的多能性、畸胎瘤的形成和分化〔12〕。已有实验证实miR-302b可以靶向抑制肝癌细胞中AKT2的表达来抑制肝癌细胞的侵袭和转移〔13〕，本研究表明miR-302b-3p可能通过与AKT1的3′-UTR靶向结合，抑制皮肤成纤维细胞中AKT1 mRNA及蛋白质的表达，从而促进皮肤成纤维细胞的衰老。

综上所述，衰老过程中皮肤成纤维细胞miRNA-302b-3p的表达升高，miRNA-302b-3p可能通过靶向抑制AKT1基因及蛋白的表达，从而加速皮肤成纤维细胞的衰老过程。