microRNA-21在神经胶质瘤患者外周血清中的表达及意义

徐敏 黄攀 何晓英

(1德阳市第二人民医院神经内外科，四川 德阳 618000；2德阳市人民医院；3西南医科大学附属医院)

神经胶质瘤(Neuroglioma)是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占颅内肿瘤的50%，发病率和死亡率均较高〔1〕，手术切除是目前最主要的治疗方式，然而由于肿瘤细胞常呈浸润性生长，与正常脑组织边界不明显，手术常难以完全清除干净，因此，积极探索更加有效的治疗方式极有必要〔2〕。随着医学技术的发展，医学发展模式已经从对症治疗转变为对因治疗，因此只有将神经胶质瘤的发病机制研究得更加透彻才能寻找到更加有效的治疗方式〔3〕。microRNA是一类长度17～22个核苷酸序列的非编码小分子物质，可通过与靶基因的mRNA结合进而影响转录后翻译的过程从而发挥调控机体生长发育和疾病发生的作用〔4〕。microRNA-21是一种与肿瘤关系密切的小分子RNA〔5〕，研究显示在多种实体肿瘤的病理组织或外周血中均存在microRNA-21的表达量增高〔6〕。然而在神经胶质瘤患者外周血清中microRNA-21的表达情况及microRNA-21的分子调控网络尚未见报道。本研究拟通过RT-PCR技术及生物信息学分析的方法进行预测。

1 资料与方法

1.1研究对象 选择德阳市第二人民医院收治的确诊为神经胶质瘤患者53例作为试验组，年龄31～68岁，平均(39.68±8.72)岁，男28例，女25例；另选取同期健康体检者50例，年龄(40.24±8.84)岁，男25例，女25例。两组年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2纳入标准 ①符合中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南者〔7〕；②临床资料完整者；③神志清楚能配合研究者；④知情同意；⑤首次确诊为神经胶质瘤者。排除标准 ①非首次确诊为神经胶质瘤或已经治疗的神经胶质瘤者；②严重心、肝、肾功能不全者；③精神异常不能配合者。

1.3标本采集 入院时对疑诊为神经胶质瘤的患者采集空腹外周静脉血，室温静置15 min后离心分离收集上层血清并编号，保存于-80℃冰箱用于后期的RT-PCR；若术后病理证实为非神经胶质瘤则剔除对应编号的血清样本。

1.4主要试剂与仪器 M-MLV 逆转录酶试剂盒、Trizol Reagent、10 mmol/L dNTP MIX均购于美国InvitrogenTM公司；内参基因U6及microRNA-21引物序列由武汉金德生物科技有限公司设计；M-MLV逆转录试剂盒购于美国Thermo Scientific公司；SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒购于美国TaKaRa公司；PCR仪购于美国ABI公司；荧光定量PCR仪购于Life technologies公司；超净工作台购于苏净安泰有限公司。microRNA-21的序列为：正义:5′-TGGGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′;反义:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′。内参基因U6序列：正义:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′；反义:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。本研究采用2-△Ct代表microRNA-21的相对表达量，△Ct=(目标microRNACt值-U6Ct值)。

1.5生物信息学分析 采用UCSC数据库对microRNA-21在人类基因组中的位置及保守性进行分析；microRNA-21的靶基因预测采用TargetScan数据库及CoMeTa数据分别进行预测，取同时出现于二者的靶基因作为microRNA-21的潜在靶基因；采用DAVID基因数据库对microRNA-21靶基因的功能和信号通路进行富集分析。

1.6统计学处理 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组外周血清microRNA-21的表达 试验组外周血清microRNA-21的相对表达量(2.53±0.95)高于对照组(1.05±0.64)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2microRNA-21在人类基因组中的位置及保守性 在UCSC基因组在线数据库中(http://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redi-rect=manual &source=genome.ucsc.edu)进行如下设置：Popular Species选择为Human，Human Assembly选择为Dec.2013(GRCh38/hg38)，在Position中输入hsa-miR-21，结果显示，microRNA-21在人类基因组中位于染色体17q23.1上的59841266-59841337位点上，长度为72 bp；而保守性分析结果显示microRNA-21基因序列在人、小鼠、大象、鸡、狗、恒河猴、非洲爪蛙、斑马鱼、七鳃鳗9个物种之间高度保守。见图1。

图1 microRNA-21在人类基因组中的位置及保守性分析

2.3microRNA-21可能靶基因预测 在Targetscan数据库(http://www.target-scan.org/)中将Select a species设置为Human，在Enter a micro-RNA name中输入miR-21-5p，结果显示共有320个可能靶基因；而在CoMeTa数据库(http://cometa.tigem.it/index.php)首页中选择miRNA target predictions(CoMeTa targets link)项，再在Type your Input中输入hsa-miR-21-5P，结果共发现791个可能靶基因。

2.4通过绘制Venn图预测microRNA-21潜在靶基因 通过网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制Targetscan数据库和CoMeTa数据库同时出现的靶基因的Venn图，结果发现共有146个潜在靶基因。见表1、图2。

表1 microRNA-21靶基因

续表1 microRNA-21靶基因

图2 microRNA-21潜在靶基因Venn图

2.5microRNA-21靶基因功能富集(GO)分析和KEGG Pathway分析 通过DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov/)基因数据库对Venn图求得的146个交集靶基因进行GO分析，结果发现microRNA-21的靶基因主要富集于RNA合成代谢、细胞增殖凋亡、转录、磷代谢、细胞信号传导等过程中。而对KEGG Pathway进行分析，结果发现microRNA-21靶基因主要富集于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、神经营养素信号通路、Janus激酶-信号转导与转录激活子(JAK-STAT)信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、轴突导向信号通路、细胞凋亡信号通路、转化生长因子(TGF)-β信号通路中。其中MAPK是常见的肿瘤信号通路，以JAK-STAT信号通路中的靶基因分布示意图见图3～5。

图3 microRNA-21靶基因KEGG Pathway分析结果

图4 microRNA-21靶基因部分GO分析结果

图5 microRNA-21靶基因在MAPK信号通路中分布

3 讨 论

由于中枢神经存在血脑屏障的保护，既往普遍认为对于中枢神经系统疾病的诊断或预测采用循环血标志物意义不大。然而，随着科学技术的进步，发现某些中枢神经系统疾病可造成血脑屏障结构或功能发生破坏，使得脑脊液中的部分物质可穿过血脑屏障进入外周循环血中，因此，这些分子在一定程度上具有预测或诊断某些中枢神经系统疾病的作用，如脑梗死、脑出血等〔8〕。microRNA是一类小分子物质，表达稳定，可在外周循环血中被稳定检测。近年研究发现microRNA-21具有促进肿瘤细胞增殖、分化等作用，然而关于microRNA-21在人神经胶质瘤患者外周血清中的表达情况及microRNA-21调控胶质瘤可能的分子网络尚不明确〔5〕。本研究利用USUC数据库发现microRNA-21定位于人染色体12q23.1上，在人、小鼠、大象、鸡、狗、恒河猴、非洲爪蛙、斑马鱼、七鳃鳗9个物种之间核苷酸序列高度保守，而RT-PCR结果显示神经胶质瘤患者外周血清中microRNA-21高表达，可能原因为由于肿瘤的侵袭、生长等可在一定程度上导致血脑屏障的破坏，肿瘤组织中产生的microRNA-21可穿过血脑屏障进入外周循环血液中，提示microRNA-21参与了神经胶质瘤的发病。microRNA发挥生物学功能是通过与特定靶基因的mRNA碱基互补配对结合，从而抑制相关mRNA转录翻译或直接降解相关mRNA的作用。为进一步探讨microRNA-21在神经胶质瘤发病中可能的分子网络，本研究结果发现microRNA-21靶基因包括BCL2、SOCS3、MEF2C、PP3CA等146个。于士柱等〔9〕研究发现BCL2抑制神经胶质瘤肿瘤细胞凋亡进而导致肿瘤细胞过度增殖引起肿瘤体积增大；Lei等〔10〕研究发现SOCS3启动子序列中的甲基化程度的高低与神经胶质瘤WHO分级有明显关系；MEF2C在神经胶质瘤中高表达，能提高胶质瘤细胞抵抗缺氧、氧化刺激及增加肿瘤细胞迁移、侵袭的能力。研究显示性别决定SOX2在正常脑组织中不表达，而在几乎所有的脑胶质瘤中高表达，有研究证实SOX2是癌症神经干细胞维持自我更新的关键因子，其可能是治疗恶性胶质瘤的潜在靶点〔11～14〕。

采用生物学信息的方法不仅能快速预测microRNA-21靶基因，还能对相关靶基因主要功能及参与的信号通路进行分析。有研究报道MAPK信号通路异常与神经胶质瘤的发生有关，Antonyak等〔15,16〕研究发现MAPK信号通路中的关键分子P-JNK在脑胶质瘤中高表达，李静等〔17〕研究显示STAT3信号途径是治愈脑胶质瘤的潜在靶标，另有研究发现TGF-β信号通路在脑胶质瘤中高度激活且其激活程度与患者预后关系密切〔18,19〕。

本研究通过RT-PCR及生物信息学方法发现microRNA-21在神经胶质瘤患者外周血清中高表达，且可通过调控多个靶基因参与多条信号通路的调节进而参与神经胶质瘤的发病，为神经胶质瘤的microRNA表达谱及其调控机制添加了新的证据，同时也为今后的研究提供了方向。