长链非编码RNA LSINCT5在乳腺癌的表达及其对细胞增殖和转移的影响

梁宝珍，张利华，林思园，王恒雨，陈雪君

·论著·

长链非编码RNA LSINCT5在乳腺癌的表达及其对细胞增殖和转移的影响

梁宝珍，张利华，林思园，王恒雨，陈雪君

523320 广东，东莞市第三人民医院/南方医科大学附属东莞石龙人民医院乳腺外科（梁宝珍、张利华、林思园、陈雪君）；510515 广州，南方医科大学南方医院普通外科（王恒雨）

探讨长链非编码 RNA LSINCT5（lncRNA LSINCT5）在乳腺癌组织的表达及其临床意义，研究其对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭功能的作用。

选取 80 例手术切除的乳腺癌组织及癌旁组织为研究对象，采用 qRT-PCR 检测LSINCT5 的表达水平。收集和分析患者临床病例资料与 LSINCT5 表达水平的相关性。将 LSINCT5-siRNA 分别转染人乳腺癌MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞系，qRT-PCR 检测 LSINCT5 的细胞表达水平，镜下观察细胞形态，CCK8 法检测细胞增殖情况，术实验检测肿瘤细胞周期变化，通过划痕实验及 Transwell 实验分别检测细胞迁移及侵袭功能的影响。

LSINCT5 的表达在乳腺癌组织及细胞系中明显升高（< 0.01）。LSINCT5 表达水平与乳腺癌患者 TNM 分期、淋巴结转移、PR 和 Ki-67 相关（< 0.01），而与年龄、病理类型、ER 和 Her2 无关（> 0.05）。下调 LSINCT5 表达的 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞系的增殖能力明显减弱，细胞周期受到抑制，且肿瘤细胞的迁移及侵袭数量显著减少，差异均有统计学意义（< 0.05）。

LSINCT5 的表达与乳腺癌发生、进展密切相关，可能成为乳腺癌诊断的潜在生物学标志物。LSINCT5 促进乳腺癌细胞的增殖和转移，可能为寻找乳腺癌新的治疗靶点提供理论依据。

乳腺癌； LSINCT5； 增殖； 转移

乳腺癌（breast cancer，BC）是最常见的女性恶性肿瘤之一，位列全球女性肿瘤发病率第一[1-2]。目前我国乳腺癌患者的死亡率与发病率呈逐年上升趋势，以 30 ~ 59 岁女性为高发人群[3]。乳腺癌的发生及进展是一个多因素参与的复杂过程，其高度异质性导致患者的临床表征、疗效及预后呈现较大的个体差异[4-5]。因此，探讨不同生物标志物在乳腺癌疾病进程中的临床意义对识别其潜在的预判因子、诊断手段与治疗靶点尤为重要。

不同肿瘤与同种肿瘤不同组织类型的 lncRNA 表达水平异常，可作为抑癌基因或癌基因直接或间接调控肿瘤相关的信号途径[6]。研究报道，在肺癌、胃癌组织中LSINCT5 的表达水平明显升高，并且调控肿瘤细胞的增殖、侵袭，与癌症患者预后不良存在密切的联系[7-8]。崔梦等[9]通过研究证实乳腺癌患者的血清 LSINCT5 表达水平较正常人明显升高。目前，LSINCT5 在乳腺癌标本中的表达及其与临床指标的关联性尚不明确，LSINCT5 与乳腺癌细胞生物学行为的相关研究亦未见报道。本研究旨在从体外细胞水平探讨 LSINCT5 对人乳腺癌细胞的增殖、转移的影响，分析乳腺癌中 LSINCT5 的表达水平与患者临床参数的相关性，为研究乳腺癌发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 80 例乳腺癌组织标本及癌旁组织选取于 2018 年 01 月 – 2019 年 01 月在本院进行手术治疗的乳腺癌患者，平均年龄（46.70 ± 2.45）岁。样本离体后立即在液氮中快速冷冻并储存在 –80 ℃，所有组织标本同时制作用于实验。纳入标准：术前经肿瘤标志物化验、乳腺钼靶和细胞学穿刺等检查高度提示乳腺癌，且均经手术病理确诊为乳腺癌。排除标准：①术前已接受放、化疗或肿瘤药物治疗；②患有其他恶性肿瘤或既往有其他肿瘤史；③自身免疫性疾病者；④合并严重器质性疾病；⑥临床资料不完整者。本研究经医院伦理委员会批准且所有患者均签署知情同意书。

1.1.2 细胞系 人乳腺上皮细胞系 MCF-10A，人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435 和ZR-75-1均购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.1.3 试剂和仪器 Lipofectamine3000 转染试剂购自美国 Invitrogen 公司；胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；CCK8 试剂盒购自日本Dojindo 公司；RNA 提取试剂盒购自日本 Takara 公司；ReverTra Ace qRT-PCR Master Mix 逆转录试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix 扩增试剂盒购自日本 Toyobo 公司；PCR 引物和PI Staining Kit购自生工生物工程（上海）股份有限公司；LSINCT5-siRNA 和 siRNA-NC 购自上海吉凯生物技术有限公司；Transwell 板购自美国 Corning 公司；real-time Thermocycler 7500 PCR 仪购自美国 ABI 公司；酶标仪购自美国 BioTek Instruments 公司；光学显微镜购自日本 Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞系培养与转染 适量细胞加入含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的DMEM 培养基中，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长约 80% 后进行传代、培养。取对数期细胞，参照 Lipofectamine3000 说明书转染。设置 NC 组和 LSINCT5-siRNA 组，即分别转染 siRNA-NC 或 LSINCT5-siRNA 的乳腺癌细胞系，置于 37 ℃、5% CO2中培养 48 h，随后收集细胞进行后续实验。

1.2.2 实时定量 PCR 检测 LSINCT5 表达水平 提取标本总 RNA，取吸光度（260/280 nm）值在 1.7 ~ 2.0 的 RNA 样本置–80 ℃保存，用于后续试验。采用逆转录试剂盒将 RNA 样本逆转录为 cDNA，置–80 ℃保存。根据 GeneBank 中 LSINCT5 基因的序列号（NM 101234261），用 Primer Primer 5.0 软件设计引物，并用 oligo7 以及 NCBI 在线工具 Primer-BLAST 比对后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以 GADPH 作为内参照，上游引物序列：5' CAATGACCCCTTCA TTGACC 3'，下游引物序列：5' TGGAAGATGGTG ATGGGATT 3'，退火温度 60 ℃，产物片段大小为 129 bp。LSINCT5 上游引物序列：5' TTCGGCAAG CTCCTTTTCTA 3'，下游引物序列：5' GCCCAAG TCCCAAAAAGTTCT 3'，退火温度 59 ℃，产物片段大小为 301 bp。PCR 反应总体系为 20 μl，包括 SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μl，10 μmol/L 上、下游引物各 1 μl，cDNA 模板 2.5 μl，ddH2O 5.5 μl。循环参数：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 45 s，共 40 个循环，收集荧光信号后进行熔解曲线分析。结果以 2-ΔΔCt法表示。试验重复 3 次。

1.2.3 流式细胞术检测 细胞转染后继续培养 48 h，胰酶消化，离心、收集细胞，PBS 洗2 遍后使用 70% 乙醇重悬细胞。在 4 ℃下固定 24 h 后离心弃上清，PBS 洗 2 遍，加入 PI 染液 300 μl，避光孵育 1 h 后上机检测。

1.2.4 CCK8 检测细胞的增殖能力 取转染后细胞悬浮于含 10% 牛血清的 RPMI1640 培养液中，调整细胞浓度为 1.0 × 105个/ml，分别接种到 96 孔培养板上，每组 3 个重复。培养 48 h 后光学显微镜下观察细胞形态，继续培育 24 h 后向各孔加入 20 μl CCK8 稀释液，振荡后继续培养 1 h，用酶标仪在 490 nm 波长下测定吸光度。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 在 6 孔板背面间隔约 1 cm 划直线，横穿过孔。在各组空板中加入约 2 × 105个细胞，贴壁生长 24 h 后用 200 μl 移液枪头垂直于 6 孔板背后的横线划痕。弃去培养液，PBS 洗涤 2 次后加入无血清培养基，置于培养箱中培养，在 0、24 h 后拍照。

1.2.6 Transwell 检测细胞侵袭能力 取转染后细胞，调整细胞密度为 1.0 × 105个/ml 的细胞悬液。取 1 ml 细胞悬液加入含有无血清培养基的 Transwell 板上层。下层加入含 10% 胎牛血清的培养基。培养 24 h 后，将上层细胞去除，用 95% 乙醇固定和 0.05% 结晶紫的染料溶液染色 15 min，棉花拭子轻刮去除非移行细胞，光学显微镜下观察、计数。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 LSINCT5 在乳腺癌组织与细胞系中的表达显著上调

为了研究 LSINCT5 在 BC 中的表达情况，通过 qRT-PCR 实验检测 80 例乳腺癌组织及癌旁组织的 LSINCT5 表达，结果提示乳腺癌组织中 LSINCT5 的表达量较癌旁组织显著增加（< 0.01）（图 1A）。进一步通过 qRT-PCR 实验检测 LSINCT5 在人乳腺上皮细胞系 MCF-10A，人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435 和 ZR-75-1 的表达，结果显示 LSINCT5 在MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞系中的表达明显高于 MCF-10A 细胞系（< 0.01）（图 1B），提示 LSINCT5 可能在乳腺癌的发展过程中发挥促进作用。为了探究 LSINCT5 在乳腺癌细胞系中的生物学功能，本研究选择 MDA-MB-231 和 MCF-7 进一步实验。通过转染 LSINCT5-siRNA 到 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞系，qRT-PCR 证实转染 LSINCT5-siRNA 后的乳腺癌细胞中 LSINCT5的表达显著下降（图1C）。

Figure 1 LSINCT5 is upregulated in human BC tissues and cells (A: The expression of LSINCT5 was measured by qRT-PCR assay; B: The levels of LSINCT5 were examined in human BC cell lines MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-435, ZR-75-1 and human normal breast epithelial cell line MCF-10A by qRT-PCR assay; C: Transfection with LSINCT5-siRNA significantly decreased its level in MDA-MB-231 and MCF-7 by qRT-PCR assay;**< 0.01)

表 1 LSINCT5 的表达与临床病理特征关系

2.2 LSINCT5 表达与患者临床病理特征的关系

统计分析结果表明，LSINCT5 的表达量与乳腺癌患者的 TNM 分期、PR 表达、淋巴结转移和 Ki-67 的相关性具有统计学意义（均 < 0.05），而与年龄、病理类型、ER 和 Her2 则无相关性（> 0.05），提示 LSINCT5 的表达可能影响乳腺癌的进展，详见表 1。

Figure 2 Down-regulation of LSINCT5 reduces proliferation of BC cells and leads to cell cycle arrest (A: The morphology of BC cells was observed under high magnification microscope; B: Estimation of cell proliferation in MDA-MB-231 and MCF-7 cells transfected with NC or LSINCT5-siRNA by CCK8 assays; C: Cell cycle distribution of MDA-MB-231 and MCF-7 cells transfected with NC or LSINCT5-siRNA was detected by FACS;**< 0.01)

2.3 抑制 LSINCT5 降低乳腺癌细胞的增殖能力并引起周期阻滞

在显微镜下观察转染 LSINCT5-siRNA 的 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞系形态并拍照（图 2A）。CCK8 检测结果显示，下调 LSINCT5 表达后乳腺癌细胞的增殖数量明显减少（图 2B）。通过流式细胞术观察抑制 LSINCT5 表达后 MCF-7 和 MDA-MB-231 的细胞周期变化。结果显示，与NC 组相比，转染 LSINCT5-siRNA 后，MCF-7 和 MDA-MB-231 的 G0/G1细胞数分别升高 29.59%、39.74%（< 0.01），S 期细胞数分别降低 21.43%、30.87%（< 0.05），G2/M 期细胞数分别减少 8.16%、8.87%（< 0.05），提示 LSINCT5 可能通过调控细胞周期促进乳腺癌细胞的增殖（图 2C）。

Figure 3 Down-regulation of LSINCT5 inhibit the migration and invasion of BC cells (A: Estimation of cell migration in MDA-MB-231 and MCF-7 cells transfected with NC or LSINCT5-siRNA by scratch assays; B: Estimation of cell invasion in MDA-MB-231 and MCF-7 cells transfected with NC or LSINCT5-siRNA was detected by Transwell migration assays;*< 0.05,**< 0.01)

2.4 下调 LSINCT5 表达抑制乳腺癌细胞的侵袭与迁移能力

通过划痕实验分析 NC 组、LSINCT5-siRNA 组细胞的迁移能力变化。结果发现，抑制 LSINCT5 表达后，乳腺癌细胞的迁移速度显著降低（图 3A）（< 0.01）。随后 Transwell 实验结果证实，降低 LSINCT5 表达后 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞的侵袭数量显著降低（< 0.01）（图 3B）。

3 讨论

lncRNA 是一类长度大于 200 个核苷酸的非编码长链 RNA[10-11]。研究报道 lncRNA 的表达紊乱普遍存在于肿瘤中，且其表达模式具有比蛋白编码基因更出色的组织特异性[12-13]。许多研究表明，lncRNA 可以作为调控因子，参与调控乳腺癌的发生及进展，例如在乳腺癌组织中高表达的 lncRNA UCA1 能够增加乳腺癌细胞的增殖能力，同时具有抑制细胞凋亡的作用[14]。lncRNA MIR210HG 被证实在乳腺癌中过表达，与患者预后相关，其能够促进乳腺癌细胞的转移[15]。

LSINCT5 长度为 2.6 kb，位于 5 号染色体（chr5: 2，765，705-2，768，351），是应激诱导长链非编码转录本，位于细胞核内。而目前关于 LSINCT5 在乳腺癌中的作用及可能机制研究尚未见报道，故研究其对乳腺癌细胞的生物学影响，将有助于乳腺癌发生、发展机制研究。本研究首先收集了 80 对乳腺癌患者术后的确诊组织标本，实验证实 LSINCT5 在乳腺癌组织中呈高表达，进一步实验明确 LSINCT5 在乳腺癌细胞系中表达升高。随后统计分析表明 LSINCT5 表达水平与 TNM 分期、是否淋巴结转移、PR 和 Ki-67 存在一定相关性，提示其可能参与调控乳腺癌进程，并可能作为乳腺癌患者评估病情进展的指标和治疗靶点。在体外细胞水平，本研究通过转染 siRNA 抑制 MCF-7、MDA-MB-231 细胞中 LSINCT5 的表达，通过 CCK8 证实 LSINCT5 的表达抑制导致 MCF-7、MDA-MB-231 细胞的增殖能力出现明显的抑制，进一步利用流式细胞术实验数据显示，降低 LSINCT5 的表达后，MCF-7 及 MDA-MB-231 细胞的 G0/G1期比例增多、S 期和 G2/M 细胞比例减少，证实下调 LSINCT5 的表达使得乳腺癌细胞周期阻滞在 DNA 复制期之前。通过划痕实验和 Transwell 实验进一步证实，下调 LSINCT5 的表达均减弱了 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞的迁移和侵袭能力。LSINCT5 在细胞出现应激反应时表达明显增强，故定义为压力诱导长链非编码 RNA[16]。应激反应普遍存在于肿瘤的发生、发展过程，而压力诱导相关 lncRNAs 和肿瘤发生高度相关。研究表明，LSINCT5 在肿瘤细胞中呈高表达，且与肿瘤浸润深度、肿瘤分期等密切相关，如胃癌组织中 LSINCT5 的表达水平是 DFS 的独立预后因素[17]，研究表明抑制 LSINCT5 在膀胱癌中的表达使得癌细胞的增殖和侵袭功能明显减弱[18]。故 LSINCT5 作为压力诱导长链非编码 RNA，可能使乳腺癌细胞周期不受控制，从而促进肿瘤的发生和转移。

综上所述，本研究为乳腺癌的发病机制提供了新的理论认识。LSINCT5 在乳腺癌组织及细胞系中呈高表达，下调 LSINCT5 的表达能够减弱乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，其可能是通过调控细胞周期而发挥作用，有可能成为乳腺癌的新治疗靶点。

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2018. CA Cancer J Clin, 2018, 68(1):7-30.

[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.

[3] Akram M, Iqbal M, Daniyal M, et al. Awareness and current knowledge of breast cancer. Biol Res, 2017, 50(1):33.

[4] Michailidou K, Beesley J, Lindstrom S, et al. Genome-wide association analysis of more than 120,000 individuals identifies 15 new susceptibility loci for breast cancer. Nat Genet, 2015, 47(4):373-380.

[5] Mcpherson K, Steel CM, Dixon JM. Breast cancer-epidemiology, risk factors, and genetics. BMJ, 2000, 321(7261):624-628.

[6] Hu X, Feng Y, Zhang D, et al. A functional genomic approach identifies FAL1 as an oncogenic long noncoding RNA that associates with BMI1 and represses p21 expression in cancer. Cancer Cell, 2014, 26(3):344-357.

[7] Tian Y, Zhang N, Chen S, et al. The long non-coding RNA LSINCT5 promotes malignancy in non-small cell lung cancer by stabilizing HMGA2. Cell Cycle, 2018, 17(10):1188-1198.

[8] Qi P, Lin WR, Zhang M, et al. E2F1 induces LSINCT5 transcriptional activity and promotes gastric cancer progression by affecting the epithelial-mesenchymal transition. Cancer Manag Res, 2018, 10:2563- 2571.

[9] Cui M, Zhang Y, Luo Q, et al. Diagnostic value of serum long non-coding RNA LSINCT5 in breast cancer. Chin J Clin Lab Sci, 2018, 36(8):570-573. (in Chinese)

崔梦, 张毅, 罗庆, 等. 血清长链非编码RNA LSINCT5在乳腺癌中的表达与临床意义. 临床检验杂志, 2018, 36(8):570-573.

[10] Ma W, Chen X, Ding L, et al. The prognostic value of long noncoding RNAs in prostate cancer: a systematic review and meta-analysis. Oncotarget, 2017, 8(34):57755-57765.

[11] Hu HL, Yang L, Deng Y, et al. Expression of lncRNA RP5-1185K9.17 in cancer tissues of the patients with colorectal cancer and its clinical significance. Chin J Cancer Biother, 2017, 24(7):773-777. (in Chinese)

胡洪林, 杨兰, 邓颖, 等. lncRNA RP5-1185K9.17在结直肠癌组织中的表达及其临床意义. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2017, 24(7):773- 777.

[12] Gutschner T, Diederichs S. The hallmarks of cancer: a long non-coding RNA point of view. RNA Biol, 2012, 9(6):703-719.

[13] Schaukowitch K, Kim TK. Emerging epigenetic mechanisms of long non-coding RNAs. Neuroscience, 2014, 264:25-38.

[14] Tuo YL, Li XM, Luo J. Long noncoding RNA UCA1 modulates breast cancer cell growth and apoptosis through decreasing tumor suppressive miR-143. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2015, 19(18): 3403-3411.

[15] Li XY, Zhou LY, Luo H, et al. The long noncoding RNA MIR210HG promotes tumor metastasis by acting as a ceRNA of miR-1226-3p to regulate mucin-1c expression in invasive breast cancer. Aging (Albany NY), 2019, 11(15):5646-5665.

[16] Silva JM, Perez DS, Pritchett JR, et al. Identification of long stress-induced non-coding transcripts that have altered expression in cancer. Genomics, 2010, 95(6):355-362.

[17] Xu MD, Qi P, Weng WW, et al. Long non-coding RNA LSINCT5 predicts negative prognosis and exhibits oncogenic activity in gastric cancer. Medicine (Baltimore), 2014, 93(28):e303.

[18] Zhu X, Li Y, Zhao S, et al. LSINCT5 activates Wnt/β-catenin signaling by interacting with NCYM to promote bladder cancer progression. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 502(3):299-306.

Expression of lncRNA LSINCT5 in breast cancer and its effects on cell proliferation and metastasis

LIANG Bao-zhen, ZHANG Li-hua, LIN Si-yuan, WANG Heng-yu, CHEN Xue-jun

Department of Breast Surgery, Dongguan Third People’s Hospital/Affiliated Shilong People’s Hospital of Southern Medical University, Guangdong 523320, China (LIANG Bao-zhen, ZHANG Li-hua, LIN Si-yuan, CHEN Xue-jun); Department of General Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China (WANG Heng-yu)

This study was aimed to investigate the expression and clinical significance of lncRNA LSINCT5 in breast cancer (BC), and its effect on the proliferation, migration and invasion of breast cancer cells.

80 cases of breast cancer tissues and adjacent normal tissues removed from BC patients after surgery were included in our study. The expression level of LSINCT5 was detected through qRT-PCR. The correlations between LSINCT5 expression and clinical collected pathological data in these cases were analyzed. LSINCT5-siRNA were respectively transfected into MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines, while the expression level of LSINCT5 was detected through qRT-PCR. Cell morphology was observed under light microscope. Then CCK8 and flow cytometry assays were performed to detect proliferation and cell cycle of tumor cells, respectively. At last, we used wound scratch assay and Transwell migration assay to examine cell migration and invasion.

The expression of LSINCT5 was significantly increased in breast cancer tissues and cell lines (< 0.01) and its expression level was correlated with TNM staging, lymph node metastasis, PR, and Ki-67 in breast cancer patients (< 0.01), while it didn’t show any correlation with age, pathological type, ER, or Her2 (> 0.05). The proliferation ability of MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines with down-regulated LSINCT5 expression was significantly decreased. The cell cycle was inhibited, and tumor cell migration and invasion was significantly reduced with statistically significant differences (< 0.05).

The expression level of LSINCT5 is closely related to the occurrence and progression of breast cancer, and LSINCT5 may be a potential biomarker in the diagnosis of BC. LSINCT5 promotes the proliferation and metastasis of breast cancer cells, suggesting that it may provide a theoretical basis for finding new therapeutic targets for breast cancer.

Breast cancer; LSINCT5; Proliferation; Metastasis

ZHANG Li-hua, Email: zlh3thh@163.com

张利华，Email：zlh3thh@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.018

2019-10-08