人冠状病毒治疗药物研究进展

全彦妮，王宜轩，李艳萍

·新型冠状病毒专栏·

人冠状病毒治疗药物研究进展

全彦妮，王宜轩，李艳萍

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所中国医学科学院抗病毒药物研究重点实验室

冠状病毒（coronaviruses，CoVs）是人畜共患病毒，广泛存在于自然界，最早从鼠身上分离得到。因为大多在家畜、鸟禽等脊椎动物间传播，主要会对农业和畜牧业造成明显影响[1-2]。动物冠状病毒进化后实现跨物种传播，感染人导致人冠状病毒（human coronavirus，HCoV）的出现[3]。较早出现的人冠状病毒如 HCoV-229E 和 OC43 病毒感染症状较轻，一般表现为类似感冒的上呼吸道感染，且多数能自愈，药物研究也较少，未被人类重视[4-5]。然而在近二十年，陆续出现了多种新型人冠状病毒，而且传染力和致病力明显增强，病毒感染导致的严重下呼吸道疾病对患者生命健康构成了巨大威胁。2003 年的严重急性呼吸窘迫综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）疫情导致全球 20 多个国家共计8000 多病例报告和 10% 的死亡率，中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）死亡率更是高达 30%，而我国武汉暴发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情自 2019 年 12 月发现至今已经导致了超过三十万的全球确诊病例。遗憾的是，到目前为止，针对这些高致病力病毒还没有明确有效的疫苗或特异性抗病毒药物上市。突发的疫情一次次刷新人类对于冠状病毒的了解和态度，也推动了冠状病毒预防和治疗方法的研究进度。本文对现有冠状病毒药物研究文献进行梳理，希望能够为突发性人冠状病毒感染治疗药物研究提供思路。

1 冠状病毒生物学特征

CoVs 是一类有包膜的正性单链 RNA 病毒，病毒颗粒直径 80 ~ 120 nm，其结构由外到内依次为：刺突、外膜、包膜、衣壳、基因组。从膜表面伸出的刺突使病毒表面近似王冠，因而得名冠状病毒[6]。冠状病毒基因组长度为 26 ~32 kb，5' 端有两个重叠的开放读码框 ORF1a 和 ORF1b，编码两个复制酶多蛋白前体 pp1a 和 pp1ab，在多蛋白 pp1ab 中含有蛋白酶，能够将多蛋白前体裂解为生成新病毒颗粒必需的一系列非结构蛋白（non-structural protein，nps）；而剩余的读码框则编码病毒结构蛋白，包括刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S）、膜蛋白（membrane protein，M）、包膜蛋白（envelop protein，E）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）以及病毒复制辅助蛋白。国际病毒委员会的 2018 版病毒分类将冠状病毒暂归为 α、β、γ 和 δ-四个属，近40 个毒种。其中感染人的冠状病毒共有 6 种（HCoV-229E、OC43、NL63、HKU1、SARS-CoV 和 MERS-CoV）（表 1）。加上我国 2019 年 12 月新出现的 SARS-CoV-2 病毒，目前发现的人冠状病毒共有 7 种。除 HCoV-229E 和 NL63 属于 α 冠状病毒属外，其他 5 种人冠状病毒均属于 β 冠状病毒属。

冠状病毒的生命周期可以分为病毒进入、病毒复制和蛋白合成、组装和出胞释放等基本步骤。在病毒进入的过程中，刺突糖蛋白 S 发挥着重要作用。S 蛋白的两个亚单位 S1 和 S2 分别负责与细胞受体结合以及病毒与细胞膜融合，二者协同介导病毒与细胞表面受体结合，启动病毒 S 蛋白构象变化，完成内化和病毒进入；同时，宿主半胱氨酸组织蛋白酶和跨膜丝氨酸蛋白酶（transmembrane protease serines，TMPRRS）已经被证实参与介导病毒进入过程中S 蛋白水解和完成膜融合的过程；病毒进入细胞后，多蛋白前体在胞浆中被蛋白酶（chymotrypsin-like protease，3CLpro和 papain-like protease，PLpro）裂解生成功能性非结构蛋白，催化病毒基因组复制和蛋白合成，在病毒的十余个非结构蛋白中，目前只对依赖 RNA 的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerse，RdRp）、解旋酶和外切核糖核酸酶的功能有了较为明确的认识，大部分非结构蛋白的功能还并不清楚；最后病毒蛋白和基因组 RNA 整合成新的病毒颗粒，通过芽生或胞吐的方式排出，这两个环节的具体机制也研究较少。

表 1 目前已证实的人冠状病毒

2 冠状病毒感染治疗药物研究

虽然冠状病毒发现时间早，种类多样，但针对人冠状病毒的研究是从 SARS 病毒出现后才得到越来越多的关注。目前的文献报道中，大部分是针对 SARS 或 MERS 等高致病病毒的研究结果。而且，多数抗病毒化合物都是源自对已上市药物或生物活性化合物库的高通量筛选。在病毒蛋白结晶结构得到证实之后，全新药物设计开始崭露头角。在病毒的整个生命周期中，每一个环节以及参与其中发挥作用的功能蛋白都可能成为研发抗病毒药物的靶点。因此，本文首先把目前文献结果依据所针对的病毒生命周期中的不同环节进行分类，然后再细化描述每类药物中涉及的作用靶点及相关药物研究进展；同时补充分析机制不明确的抗病毒活性化合物，但对完全虚拟筛选的研究结果不做讨论。

2.1 病毒进入抑制剂

2.1.1 靶向刺突蛋白与受体相互作用的抗体药物 S 蛋白具有免疫原性，能够诱导宿主免疫反应，因此，作为抗体药物研究靶点受到一定关注。公开的文献报道大部分是以 SARS 或 MERS 病毒 S 蛋白的特定序列或相应细胞受体的部分结合区域作为抗原表位开发的单克隆抗体，这类抗体能够直接中和病毒或者通过阻止刺突蛋白与细胞受体结合来实现预防或治疗病毒感染[7-8]。多个单抗药物已经在动物模型上被证实具有强病毒中和活性，比如抗 MERS 病毒的 m336，作为预防用药能够降低兔体内病毒滴度达到 40 ~ 9000 倍[9]，还有研究表明，当靶向 S 蛋白 HR1 结构域的多肽 HR2P-M2 与 m336 联合使用时，其抗 MERS-CoV 活性比单药使用时更高[10]。我国科学家从 MERS 恢复者血浆中提取得到的单克隆抗体 MCA1能够阻断病毒与细胞受体 DPP4 之间的相互作用，动物实验显示其不仅明显改善了病毒感染动物的肺部病理，而且完全抑制了猴体内 MERS 病毒的复制[11]。另外，两个靶向病毒 S 蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）表位的单克隆抗体 REGN3051 和 3048 不仅在动物模型上显示出对 MERS 病毒的预防和治疗效果，并且已经完成 I 期临床研究[12]。Luke 等[13]通过实验发现，多克隆抗体 SAB-301 能使 MERS-CoV 感染的 Ad5-hDPP4 受体转导小鼠的肺病毒滴度接近或低于检测极限。由于不同冠状病毒 S1 上与受体结合的基因差异，导致靶向 S 蛋白 S1 受体结合域 RBD 的抗体药物也会不同，因此以 RBD 区域设计的抗体药物不具有广谱应用的特性[14]。Wrapp 等[15]也证实靶向 SARS 病毒RBD 的三种单克隆抗体（S230、m396 和 80R）与新型冠状病毒 SARS-CoV-2 之间缺乏交叉反应活性。因此，对于新出现的突发冠状病毒，基于刺突蛋白的治疗抗体需要依靠分离自身病毒来制备。

2.1.2 刺突蛋白与宿主细胞受体结合抑制剂 不同冠状病毒刺突蛋白的 S1 上 RBD 差异大，因此通过识别不同的宿主细胞膜受体并发生相互作用来实现病毒穿入（表 1）[16]。HCoV-NL63、SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的 S 蛋白均结合人表皮细胞膜上的血管紧张素转化酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）；MERS 病毒和 229E 病毒的细胞表面受体分别是二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP-4）和氨肽酶N（APN）；而 HCoV-OC43 和 HKU1 的 S 蛋白则通过结合 O-乙酰唾液酸来启动进入[17-21]。这类病毒-宿主相互作用阐释也促进了治疗药物的发现研究。Kao 等[22]发现VE607（1，图 1）能够阻断 SARS-CoV 的 S 蛋白与 ACE2 结合介导的病毒进入，其抑制 SARS-CoV 的 EC50值为 1.6 μmol/L。SARS-CoV-2 与 SARS 病毒类似，也是利用 ACE2 实现病毒进入宿主细胞[23]。而且，最新 SPR（surface plasmon resonance）实验研究显示，新病毒的S 蛋白与 ACE2 的亲和力是 SARS 病毒的 10 ~ 20 倍[15]。研究者发现，阳离子衍生壳聚糖聚合物 HTCC （N-(2-hydroxypropyl)-3-trimethylammonium chitosan chloride， 2，图 1）及其疏水衍生物能够与刺突蛋白结合，从而阻止冠状病毒 NL63 与细胞受体 ACE2 的相互作用而产生抑制病毒复制的活性，通过 CPE 方法测定HTCC 抑制 NL63 病毒复制的 IC50为 10 μg/ml[24]。而且 HTCC 不同聚合物对几种低致病力冠状病毒（冠状病毒 OC43、229E 和 HKU1）分别显示出体外抗病毒活性[25]。

2.1.3 肽类病毒融合抑制剂 冠状病毒刺突蛋白是一个病毒融合蛋白，其被酶水解切割后生成 S1 和 S2 两个亚单位。S1 亚单位上的 RBD 与受体结合后，S2 亚单位负责介导病毒与细胞膜的融合。研究显示，在 SARS 病毒刺突蛋白 S2 上含有两个七肽重复序列 HR1 和 HR2，HR1 和 HR2 能够通过相互作用使 S2 发生结构变化，形成与细胞膜类似的六聚体结构，介导病毒与细胞膜融合。因此，根据这两个七肽重复序列可以设计抗病毒肽，通过抑制 HR1 和 HR2 介导的刺突蛋白结构变化，阻断膜融合。Liu 等[26]分别针对 HR1 和 HR2 的氨基酸序列设计了不同长度的肽段，通过测定这些肽段对 SARS 病毒复制的影响以及分子结合实验，发现了一个由 HR2 的 1153-1189 残基衍生的抗病毒肽先导物 CP-1（IC50= 19 μmol/L）。在 MERS 病毒出现后，该研究组解析了 MERS 病毒刺突蛋白 S2 亚单位的蛋白结晶结构，并在此基础上基于上述类似的原理，构建了多个能够覆盖 HR1 和HR2 结合区域的新肽段，发现其中一个 HR2 衍生肽段 HR2P 能够有效抑制 MERS 病毒的复制（IC50= 0.6 μmol/L）以及刺突蛋白介导的膜融合（IC50= 0.8 μmol/L），同时发现在 HR2P 的结构中引入亲水氨基酸能够改善溶解性、稳定性和抗病毒活性[27]。

图 1 冠状病毒进入抑制剂

2.1.4 II 型跨膜丝氨酸蛋白酶 TMPRRS2 介导的融合抑制剂 TMPRRS2 是一种在呼吸道表皮细胞表达的宿主细胞跨膜丝氨酸蛋白酶，具有活化病毒表面糖蛋白，促进病毒以非内吞途径进入细胞的作用。已有研究显示，TMPRRS2 能够活化 SARS、MERS 和 NL63 病毒通过非内吞途径进入细胞的膜融合过程[28-29]。而且，冠状病毒 229E 临床分离株可能更多依赖 TMPRRS2 介导的融合方式进入人呼吸道表皮细胞[30-31]。因此，TMPRRS2 抑制剂具有抗冠状病毒药物的研究潜力。甲磺酸卡莫司他是一个用于治疗胰腺炎的小分子丝氨酸蛋白酶抑制剂上市药物。卡莫司他（camostat，3，图 1）不仅在表达 ACE2 和 TMPRSS2 酶的细胞模型上阻止了 SARS 病毒和 NL63 病毒与细胞膜的融合，动物实验结果显示，卡莫司他可有效保护小鼠受 SARS-CoV 感染所致的死亡，存活率为 60%[32-33]。Yamamoto 等[34]通过建立特定的 MERS-细胞融合模型筛选 1000 多个 FDA 上市药物后，发现并确证丝氨酸蛋白酶抑制剂萘莫司他（nafamostat，4，图 1）具有依赖 TMPRRS2 酶活性，阻止 MERS 病毒膜融合的作用，IC50为 0.1 μmol/L。而且，在病毒感染体外模型上，萘莫司他在 1 nmol/L 浓度下显示出明显的抗 MERS-CoV 复制的活性，活性强度是化合物卡莫司他的 100 倍。近日，最新药物筛选研究证实萘莫司他对SARS-CoV-2 病毒也具有一定的抑制活性（EC50= 22.50 μmol/L，CC50> 100 μmol/L，SI > 4.44）[35]。

2.1.5 组织蛋白酶抑制剂 针对 SARS-CoV 的蛋白酶抑制剂研究显示，组织蛋白酶L 抑制剂 MDL28170（5，图 1）抑制了 S 蛋白介导的病毒感染，同时认为相比组织蛋白酶 B，组织蛋白酶 L的蛋白水解作用对于病毒进入和感染可能更重要。Zhou 等[33]在高通量药物再评价筛选中发现小分子组织蛋白酶B 和 L双重抑制剂 K11777（6，图 1）能够抑制多种冠状病毒（SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-NL63）进入细胞，体外 IC50在纳摩尔浓度水平。同时，该研究报道显示，联合组织蛋白酶抑制剂K11777 和蛋白酶抑制剂卡莫司他能够明显增强体外抗病毒作用，但遗憾的是，在 SARS-CoV 感染动物实验中K11777 衍生物单用或与卡莫司他联合均没有得到阳性结果。Elshabrawy 等[36]通过高通量筛选发现小分子广谱抗病毒化合物5705213（7，图 1）及其衍生物能特异性地抑制组织蛋白酶 L 水解蛋白的作用，抑制 SARS-CoV 假病毒进入细胞。并且，7与 TMPRSS2 抑制剂联用具有协同作用。

2.1.6 其他病毒进入抑制剂 Adedeji 等[37]曾通过带有 SARS 病毒表面糖蛋白的假病毒模型，对化合物库进行筛选得到三个 SARS 病毒进入抑制剂（SSAA09E1、SSAA09E2 和 SSAA09E3，图 1），并且发现这三个化合物拥有三种不同的作用机制。SSAA09E1（8）通过抑制组织蛋白酶 L 的活性阻止病毒 S 蛋白水解；SSAA09E2（9）抑制了病毒与细胞受体 ACE2 的相互作用；SSAA09E3（10）则抑制了病毒的膜融合。Apaydın 等[38]合成了一系列以 1-硫杂-4-氮杂螺[4.5]癸-3-酮为骨架的流感病毒融合抑制剂化合物，同时发现这类化合物还具有抗冠状病毒的活性，化合物11（图 1）体外抗 HCoV-229E 病毒的 EC50为 5.5 μmol/L。Lundin 等[39]在筛选抗 HCoV-229E 病毒化合物时，从一万多化合物中发现化合物 K22（12，图 1）能够有效抑制病毒复制，体外 EC50为 0.7 μmol/L，并且发现K22 在病毒进入阶段的后期显示出最强的抗病毒活性。机制研究显示，K22 通过抑制病毒进入细胞后双层膜囊泡的形成，而阻断了病毒 RNA 合成。虽然K22 耐药变异出现在 nsp6 蛋白残基，但是其作用靶点是否就是 nsp6 还不清楚；另外，K22 在体外还显示出广谱抗冠状病毒活性，对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 均具有抑制活性。Yi 等[40]通过筛选中草药提取物库，发现小分子葡萄糖四没食子酸酯TGG（Tetra--β-D-glucose，13，图 1）和木犀草素（luteolin，14，图 1）能够阻止带有 SARS 表面刺突糖蛋白的假病毒进入细胞，并在野生病毒感染细胞模型上证实了这两个化合物的抗病毒活性（EC50值分别为 4.5 和 10.6 μmol/L）。

2.2 病毒复制抑制剂

2.2.1 病毒蛋白酶 3CLpro抑制剂 3C样蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease，3CLpro）是位于冠状病毒非结构蛋白 nsp5 上的半胱氨酸蛋白酶，负责催化冠状病毒前体多蛋白水解为病毒功能蛋白。3CLpro单体无活性，二聚体具有催化活性。其酶活性结构中含有 Cys-His 二元催化单元，His 帮助 Cys 脱去氢质子产生亲核性的半胱氨酸，开始对目标蛋白水解加工。SARS 病毒 3CLpro与六肽基氯甲基酮（Cbz-Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln-CMK，15，图 2）复合物的 X 射线晶体结构显示：3CLpro单体含有三个结构域（I、II 和 III），抑制剂的结合区域位于 I 和 II 之间的狭缝处，3CLpro的底物结合亚单位 S1 对底物 P1 区的谷氨酰胺有特异性的要求[41]。3CLpro作为冠状病毒主要蛋白酶具有较高保守性，因此成为广谱抗病毒药物的重要靶点[42]。Pillaiyar 等[43]在 2016 年曾对 SARS 病毒 3CL 蛋白酶抑制剂做了非常系统的综述，详细阐述了近 200 个肽类似物或小分子抑制剂的研究结果。因此，本文将不再赘述，仅在其基础上对近几年的新进展进行阐述。

首先，蛋白酶抑制剂 GC376（16，图 2）已经被证明可以用于猫的冠状病毒感染治疗，Galasiti Kankanamalage等[44]从 GC376 与 MERS-CoV 的 3CLpro蛋白复合物结晶出发，基于增加化合物与 S3 位点作用力和改善化合物溶解性质的目的，设计合成了 P4 位置含有取代哌啶基团的一系列新型肽模拟物，在生化和细胞水平上证实了这类化合物对 MERS-CoV 蛋白酶的抑制活性以及抗 MERS-CoV 活性，同时用 X 射线衍射证明了活性化合物17（图 2）靶向 3CLpro的作用机制。AG7088（18，图 2）是已知的小 RNA 病毒3C蛋白酶抑制剂，但是对 MERS-CoV 没有抑制活性。Kumar 等[45]通过化学改造得到了一类带醛基弹头的肽类似物。在筛选抗 MERS-CoV 化合物的过程中，发现这类化合物的抗病毒潜力，其中有三个类似物（19，图 2）对 MERS-CoV、HCoV-229E 和 OC43 均有抗病毒活性，EC50在微摩尔浓度，而且对 MERS-CoV 的活性最强。以六肽 CMK 衍生物为起点的肽或拟肽类 3CLpro抑制剂结构优化一直在进行，研究进展主要体现在弹头连接和共价失活的优化策略变化上。最近，Zhang 等[46]在前期研究基础上通过在 P1 位置引入 α-酮酰胺（图2），设计合成了一类新型的肽模拟物，并在复制子细胞模型上证实多个化合物（20，图 2）对 α 和 β 两个种属的冠状病毒（HCoV-NL63、MERS-CoV、SARS-CoV）均显示明显抑制活性，体外 IC50在低微摩尔水平；更值得一提的是，在 MERS 病毒感染的 Huh7 细胞模型上，这类化合物的抗病毒活性达到了低纳摩尔水平。尽管有较多的前期研究，可能是因为肽类化合物成药性低的原因，至今还没有进入临床试验，动物实验也比较少见报道，多数还仅限于生化或细胞水平的结果。

日本 Akaji 研究组一直在进行 R188I 突变 SARS 病毒 3CLpro抑制剂研究，为了降低肽链酶解和共价结合毒性问题，他们以前期研究的肽类抑制剂21（图 3）为起点，致力于设计新型骨架来替换肽链和更安全的弹头基团替代醛基[47-48]。通过在 P2 区扩展引入大体积疏水性骨架先后设计合成了新型含有氢化异喹啉骨架（22，图 3）和八氢异色烯骨架（23，图 3）的拟肽类酶抑制剂；在氢化异喹啉骨架类化合物的研究中，分别在提高溶解性和安全性方面取得了相应的进展，发现了亲水性增强的衍生物24（图 3）和更安全的新型硫缩醛弹头衍生物25（图 3）。但上述工作只考察了化合物对酶的抑制活性，没有抗病毒活性的数据，目前的酶活性数据还有待改善。另外，他们采用骨架跃迁还设计了基于丝氨酸骨架的新拟肽化合物 SK23（26，图 3）以及苯基异丝氨酸化合物 SK80（27，图 3），为后期的小分子 3CLpro抑制剂发现奠定了基础[49-50]。苯并三唑已经被证实是小分子 3CLpro抑制剂的活性骨架。Karypidou 等[51]通过对合成的库筛选发现了一个对 HCoV-E229 具有微摩尔级抑制活性的稠环三唑类新结构化合物（28，图 3），体外 EC50在 10 μmol/L 左右。他们通过计算机模拟和对接分析确定活性化合物的靶点可能是 3CLpro。此外，黄酮类化合物草棉黄素（29，图 3）和漆叶苷（30，图 3）也曾被证实对 SARS 和 MERS-3CLpro具有抑制活性，从而发挥抗病毒复制的作用[52-53]。

图2 拟肽类3CLpro抑制剂的发现和主要结构类型

图 3 抗耐药冠状病毒3CLpro蛋白酶抑制剂及小分子3CLpro抑制剂

2.2.2 木瓜样蛋白酶抑制剂 冠状病毒木瓜样蛋白酶（papain-like protein，PLpro）位于 nsp3 上的半胱氨酸蛋白酶，具有去泛素化功能[54]。一般冠状病毒编码两个木瓜样蛋白酶 PLP1 和 PLP2，但是 SARS 和 MERS 病毒编码一个木瓜样蛋白 PLpro。现在 PL 蛋白酶抑制剂的研究大都是针对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的 PLpro进行的，SARS 病毒 PLpro的活性位点含有一个与 3CLpro二元催化单元类似的 Cys112-His273-Asp287 三元催化单位，其中的 Asp287 的功能是协助 His273 催化 Cys112 脱氢，酶催化原理与 3CLpro类似，均是 Cys 由 His 协助催化脱氢后通过亲核进攻实现对目标底物水解切割[55]。在 SARS 病毒的 PL 蛋白结晶结构被解析之前，寻找 PLpro蛋白酶抑制剂的主要途径是高通量筛选。2011 年，Frieman 等[56]首先建立了一个 PLP 酶活性诱导的慢生长酵母筛选体系，并对 NIH 化合物库中的 2000 个结构多样化合物进行了筛选。虽然化合物NSC158362（31，图 4）和 NSC158011（32，图 4）被证实能逆转 PLP 酶诱导的慢生长，而且31在细胞水平对SARS-CoV 也具有明显的抑制活性，但对 PLP 酶活性却没有直接抑制作用；而32没有抑制病毒生长的作用，但存在对PLP 酶活性的抑制。Ratia 等[57-58]先建立了一个高灵敏度带有荧光报告基团的 PLpro抑制剂筛选模型，通过对 50 080 个化合物筛选发现化合物 7724772（33，图 4）和 6577871（34，图 4）能剂量依赖地抑制 PLpro活性，IC50为 20 和 59 μmol/L，以这两个化合物为起点，先后结构优化衍生出两个选择性 PLpro非共价抑制剂GRL0617（35，IC50= 0.6 ± 0.1 μmol/L，图 4）和36（IC50=0.32 ± 0.01 μmol/L，图 4），同时证实35和36具有抗SARS-CoV 复制活性，EC50分别为（14.5 ± 0.8）和（9.1±0.5）μmol/L。该研究还获得了多个活性化合物与 PLpro复合物结晶，为后期结构优化奠定了基础[59]。双硫仑（disulfilam，37，图 4）是一种硫醇反应性化合物，可以共价修饰半胱氨酸残基。Lin 等[60]通过实验得出，双硫仑对 SARS 和 MERS 的 PLpro酶均表现出剂量依赖性抑制作用，但作用机制不同，它是 SARS-PLpro的共价不可逆抑制剂，同时是 MERS-PLpro的变构调节抑制剂。IC50分别是（24.1 ± 1.8）、（14.6 ± 1.3）μmol/L。巯嘌呤类肿瘤治疗药物 6-巯基嘌呤（6-MP，38，图 4）和 6-硫鸟嘌呤（6-TG，39，图 4）也曾被发现是 SARS-PLpro的竞争性抑制剂，同时具有抗 SARS-CoV 活性，IC50分别为（26.9 ± 7.5）和（24.4 ± 4.3）μmol/L[61]。后续研究进一步证实这两个化合物也是 MERS-PLpro抑制剂，它们与免疫抑制剂霉酚酸联合还具有协同的抗 MER-CoV 活性[62]。但是，可以预测这类抗肿瘤化合物的毒性问题最终会限制它们的抗病毒应用前景。

图 4 冠状病毒PLpro蛋白酶抑制剂

Lee 等[63]通过测定 MERS-PLpro蛋白结晶发现其与 SARS-PLpro蛋白结构大致相同，也具有去泛素化活性，但是在抑制剂结合位点存在明显不同。得出这两个病毒的 PLpro酶抑制剂可能不具有交叉效应的结论，并在对 25 000 个化合物同时进行 SARS-PLpro和 MERS-PLpro抑制活性筛选后，证实了这个推测。而且，筛选还发现了具有不同作用机制的双重酶抑制剂小分子片段。从而再次证明 MERS 病毒的 PLpro酶与 SARS 病毒的 PLpro酶对抑制剂具有不同的识别模式。采用类似的方法，该研究小组又对 30 000 个商业化合物开展了 MERS-PLpro抑制剂的定向筛选，并对得到的阳性化合物进行多轮活性和机制的验证，确定了先导化合物40（图 4）。目前他们计划将这两部分工作结合起来以发现新结构的 MERS-PLpro抑制剂[64]。

另外，多个具有广泛的生物活性的天然产物被研究证实具有 PLpro抑制活性，如多酚类（41，图 4）[65]、黄酮天竺葵酯（42，图 4）[66]、丹参酮（43，图 4）[67]、肉桂酰胺（44，图 4）[68]、查尔酮（45，图 4）[69]、姜黄素类化合物（46，图 4）[70]。上述天然产物的研究结果多数是基于生化水平分析方法的酶抑制活性，缺少对于细胞水平病毒复制的影响数据，用于抗病毒药物研究的潜力有待开发。

2.2.3 依赖 RNA 的 RNA 聚合酶（RdRp）抑制剂 RdRp 位于非结构蛋白 nsp12 内，是 RNA 病毒基因复制的关键酶。因为是病毒特异性蛋白，所以作为抗病毒药物的重要靶点，具有副作用小的优势[71]。Remdesivir（RDV，GS-5734，47，图 5）是一个腺苷单磷酸酯前药，在体内能快速生成活性三磷酸形式掺入病毒 RNA 合成，抑制 RdRp 活性，终止病毒复制，发挥抗 RNA 病毒作用[72]。目前已经完成治疗埃博拉病毒感染的 II 期临床研究。除了埃博拉病毒，RDV在体外对 MHV、MERS-CoV 和 SARS-CoV 等复制均显示出显著抑制活性，EC50分别为 0.03、0.074 和0.069 μmol/L，在恒河猴动物模型上对 MERS 病毒感染显示出预防和治疗的双重效果[73-74]。而且，RDV 对病毒 RdRp 和核酸外切酶均有抑制活性，具有耐药屏障高的优势[75]。我国的筛选研究也证实，RDV 对新型冠状病毒SARS-CoV-2 复制有抑制活性，在 SARS-CoV-2 感染的 VeroE6 细胞体系中 EC90值为 1.76 μmol/L[35]。目前，RDV 正在武汉开展治疗新冠肺炎的 III 期临床，预计不久会有结果公布。Galidesivir（BCX4430，48，图 5）也是一种腺嘌呤核苷类似物，Warren 等[76]通过实验证实，其能通过诱导 RNA 链终止来抑制病毒 RNA 聚合酶的功能，并评估了 galidesivir 对多种 RNA 病毒的抑制活性，其中抑制 MERS-CoV 的 EC50为 68.4 μmol/L，抑制 SARS-CoV 的 EC50为 57.7 μmol/L。通过靶向RdRp 和 S-腺苷-I-同型半胱氨酸水解酶（SAH）的双重抑制剂设计，一系列 6'-氟代芒霉素类似物也被合成并证实了抗冠状病毒的活性。其中，代表化合物49（图 5）表现出广谱的抗病毒活性，其抗 SARS-CoV 和 MERS-CoV活性的 EC50分别为 0.5 和 0.2 μmol/L[77]。

图 5 冠状病毒复制抑制剂

2.2.4 解旋酶抑制剂 解旋酶是一种利用 ATP 水解产生的能量催化分离双核苷链的机动蛋白，冠状病毒也编码解旋酶，位于基因组 nsp13 位置，在病毒 mRNA 转录和翻译等多个环节发挥作用[78]。SSYA10-001（50，图 5）是一个解旋酶非竞争性抑制剂，通过特异性阻断冠状病毒 nsp13 蛋白对双链 RNA 和双链 DNA 的解链活性（IC50分别为 5.70 和 5.30 μmol/L），发挥抗多种冠状病毒（SARS-CoV、MHV 和 MERS-CoV）的活性，SSYA10-001 体外抑制 SARS-CoV 和 MERS-CoV 复制的 EC50分别为 7 和25 μmol/L[79-80]。在此基础上，Zaher 等[81]利用基于解旋酶活性的荧光共振能量转移模型，合成并考察了一系列三唑类衍生物对 MERS-CoV 解旋酶的抑制活性，化合物51（图 5）对 MERS-CoV 解旋酶抑制活性最强，IC50为2.5 μmol/L，同时文献采用虚拟对接进行了靶点验证，但未进行细胞水平抗病毒活性的考察。

2.2.5 其他病毒复制抑制剂 洛匹那韦（lopinavir，LPV，52，图 5）和利托那韦（ritonavir，RTV，53，图 5）都是 HIV 病毒蛋白酶抑制剂，二者的复方片（克力芝）通过 RTV 抑制细胞色素 P450 代谢活性，实现了增强药效的目的。克力芝抗 CoV 的潜力源于对抗病毒药物的经验筛选和医院内服药艾滋病人抵抗 SARS 病毒的临床发现[82-84]。在 MERS 疫情出现时，LPV-RTV 组合也显示出治疗潜力，被应用于临床研究。而我国针对 SARS-CoV-2 感染引发的新冠肺炎应急治疗也纳入了该药物组合，多项克力芝联合干扰素、利巴韦林或其他抗病毒药物的治疗方案正在进行临床研究。尽管有研究将这两个抗 HIV 药物与 SARS-CoV 的 3CLpro进行了结合动力学模拟和对接分析，表明它们能够与 3CLpro的活性位点发生相互作用，但确切的抗冠状病毒机制至今未明[85-86]。

利巴韦林（ribavirin，RBV，54，图 5）是致突变核苷类似物，能够作为非天然核苷掺入 RNA 合成，导致基因突变，从而起到降低病毒毒力和抑制病毒复制的作用。RBV 已经被证实具有广谱抗病毒活性，临床上用于呼吸合胞病毒和 HCV 病毒感染治疗。虽然 RBV 在 SARS 和 MERS 疫情暴发期间都曾与干扰素联合用于抗病毒治疗，但其临床疗效并不显著[87]。原因可能有两个：第一，RBV 的体外抗冠状病毒活性并不强，因此正常给药剂量下的血药浓度不能达到其抗病毒药效浓度，导致临床效果不佳[87-90]；第二，冠状病毒含有校对功能的核酸外切酶，能够纠正 RBV 掺入 RNA 引起的致突变效应，导致其效力降低[91-92]。另外一个致突变核苷类似物β-d-4-羟基胞苷（NHC，55，图 5）在十几年前被 Barnard 等通过筛选发现，其在 6 μmol/L 给药浓度下对一株 SARS 病毒生成的抑制率达到 90%，但后期在 SARS 病毒感染小鼠模型上没有得到活性验证[93-94]。最近，另外一个独立的研究组发现NHC 具有抗鼠肝炎冠状病毒（MHV）和 MERS-CoV 的活性，体外抗病毒的EC50分别为 0.17  和 0.56 μmol/L，而且发现病毒核酸外切酶对 NHC 的抗病毒强度影响不大，此外，NHC 具有耐药屏障高的优势[95]。

2.3 基于宿主细胞因子的抗病毒药物

病毒的整个生命周期都离不开宿主细胞因子的参与，而且，特定的宿主因子能对生物学特征类似的病毒产生相同的影响，因此，宿主靶向抗病毒药物也通常被证实具有广谱抗病毒活性。干扰素（IFNs）是宿主靶向抗病毒药物的典型代表，IFN 是宿主细胞受到病毒感染后产生的能够抑制病毒的抵抗蛋白质，主要功能是抑制病毒的转录及 mRNA 的合成、翻译，阻止病毒蛋白合成并影响病毒的成熟和释放。因此，重组 IFNs 的使用能够增强宿主免疫反应，在多种病毒感染，特别是没有治疗药物的突发或未知病毒的治疗过程中起到重要作用。在 SARS 和 MERS 疫情期间，IFNs 被用于临床治疗，但是临床受益存在争议[87, 96]。有研究者考察了不同亚型干扰素的体外抗 MERS 病毒活性，结果显示，不同亚型的干扰素对 MERS 病毒敏感性存在显著差异，IFN-β（IC50= 1.37 U/ml）的体外抗 MERS 病毒活性最强，分别是其他亚型干扰素的数十甚至上百倍[97]。因此，采用 IFN-β 进行临床治疗可能更有利[98]。

硝唑尼特（nitazoxanide，NTZ，56，图 6）是一个治疗寄生虫感染的特效药物，也是具有广谱抗病毒活性的多功能分子[99]。作用机制研究显示，NTZ 及其代谢产物能够增强宿主抗病毒反应，提高干扰素刺激因子的表达[100-101]。最近我国的科学家发现 NTZ 对新冠病毒 SARS-CoV-2 也具有一定的抑制活性，体外 EC50为 2.12 μmol/L。

多个研究结果显示，次黄嘌呤核苷-5'-单磷酸脱氢酶（IMPDH）抑制剂霉酚酸（mycophenolic acid，MPA，57，图 6）是一个广谱抗病毒化合物，除了抑制多种病毒复制的活性外，MPA 还能诱导干扰素刺激因子的表达，增敏病毒对干扰素的反应性[102]。研究分别证实，MPA 对 MERS 病毒的复制有抑制活性，体外 EC50在微摩尔水平，并显示出与 INF-β 的协同增效作用[90, 97]。然而，免疫抑制活性以及致畸毒性问题对于体外抗病毒活性并不强的 MPA 来说是作为抗病毒药物应用的极大障碍。

亲环蛋白（cyclophilins，Cyps）是一类肽-脯氨酰异构酶，人体表达 7 种主要的亲环蛋白（CypA、CypB、CypC、CypD、CypE、Cyp40 和 CypNK），其中 CypA 参与多种病毒复制，是病毒复制伴侣蛋白。CypA 抑制剂环孢素 A（cyclosporin A，58，图 6）能够抑制多种冠状病毒，如 SARS-CoV、HCoV-229E 和 NL-63 的复制，体外 EC50分别为 3.3、2.3 和 2.3 μmol/L。同时它在SARS 病毒的复制子模型上也表现出剂量依赖的抗病毒作用，说明环孢素 A 作用于病毒基因组复制阶段[103]。Ma-Lauer 等[104]则进一步证实环孢素 A 通过阻止 CypA 与病毒核衣壳蛋白的相互作用，抑制病毒核衣壳脱衣和基因组复制。

抗疟药氯喹（chloroquine，59，图 6）曾多次被研究者在高通量筛选中发现具有抗冠状病毒的活性，对不同病毒类型的体外 EC50都在微摩尔级[84, 105-107]。氯喹通过提高细胞内 pH 值而抑制了细胞内吞作用，从而起到降低病毒进入的作用[108]。还有研究显示，氯喹的抗冠状病毒 229E 活性可能与抑制细胞 p38-MAPK 激酶活化有关[107]。但遗憾的是，氯喹在 SARS 病毒感染的动物模型上并没有显示出活性[94]。在针对 2019 新冠病毒的药物筛选中，氯喹也被证实具有体外抑制病毒复制的活性[35]，Yao 等[109]通过实验测定了氯喹和羟氯喹抗 SARS-CoV-2 的活性，体外 EC50分别为 5.47 和 0.72 μmol/L。目前，我国正在开展氯喹用于新冠肺炎治疗的临床研究（ChiCTR2000029609）。

2.4 蛋白激酶抑制剂

蛋白激酶是细胞信号通路的重要调节因子，在病毒-宿主发生相互作用的过程中，多种蛋白激酶被证实参与病毒复制。2014 年，Sisk 等[110-111]在寻找抗 MERS 病毒药物时，通过筛选发现 Abelson（Abl）激酶抑制剂伊马替尼（imatinib，60，图 6）和达沙替尼（dasatinib，61，图 6）对 SARS 和 MERS 病毒复制具有微摩尔级抑制活性。后期的研究表明伊马替尼能够抑制病毒进入阶段的膜融合环节从而抑制病毒生成，并且证实其作用靶点 Abelson 酪氨酸蛋白激酶2（Abl2）是 MERS 和 SARS 病毒复制的辅助因子。Src 家族酪氨酸激酶抑制剂塞卡替尼（saracatinib，62，图 6）对MERS 病毒复制也显示出抑制活性，并且同样是在病毒复制的早期发挥作用[112]。

图 6 宿主靶向抗冠状病毒活性化合物

2.5 具有抗病毒活性的神经受体调节剂

在针对上市药物再评价的高通量筛选研究中，多个神经递质抑制剂被发现具有抗 SARS 或 MERS 病毒活性。在de Wilde 等[84]的研究中，多种神经递质抑制剂，如氯丙嗪（chlorpromazine，63，图 6）、氟奋乃静（fluphenazine，64，图 6）、异丙嗪（promethazine，65，图 6）、三氟丙嗪（triflupromazine，66，图 6）、阿司咪唑（astemizole，67，图 6）和氯丙咪嗪（clomipramine，68，图 6）等，在微摩尔水平抑制了 MERS 病毒复制和 MERS 假病毒的内吞，同时，氯丙嗪、氟奋乃静和异丙嗪还显示出抑制细胞膜融合的作用[113]。氯丙嗪和阿片受体激动剂洛哌丁胺（loperamide，69，图 6）还被证实对 SARS、MERS 和 229E 三种冠状病毒均具有抗病毒活性。

2.6 传统中药治疗 SARS-CoV-2 感染的效果

SARS-CoV-2 引起的新冠肺炎具有中医寒疫病特征，因此，传统中药治疗也被我国纳入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，并分别针对医学观察期人群和确诊病例制定了不同的给药方案。医学观察期人群推荐使用藿香正气胶囊和连花清瘟颗粒等清热解毒中成药进行预防干预，而确诊病例则根据症状分型给予不同处方的清肺排毒汤方剂治疗。连花清瘟颗粒由连翘、金银花、麻黄（炙）等 13 味中药组成，能够有效缓解病毒性呼吸系统疾病，对 SARS 和 MERS 冠状病毒也具有明显的抑制和杀伤作用。最新研究表明，连花清瘟颗粒能够明显改善 SARS-CoV-2 感染患者的发热、咳嗽、乏力、气短等临床症状，降低轻症患者向重症转移比例[114-115]。“清肺排毒汤”出自张仲景所著的《伤寒杂病论》，主要由麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤、五苓散组成，此外融合了大青龙汤、橘枳姜汤和茯苓杏仁甘草汤等方意[116]。王饶琼等[117]通过分析清肺排毒汤治疗98 例新型冠状病毒肺炎患者的临床疗效得出，清肺排毒汤能显著改善患者的异常生化指标和临床症状，而且患者不良反应发生率低，其治疗 9 d 后的总有效率为 92.09%。

由于中药成分复杂，作用机制不能像单体化学药那样得到清楚的阐述，因此我国传统中药一直受到国外研究者的质疑，特别是在临床试验的设计和结果判定上难以得到国际认可。但在本次疫情中，传统中药对于 COVID-19 的治疗起到了非常积极的作用。相信随着中西医结合和网络药理学的发展，无论是中药有效单体分离还是传统方剂的科学推广都将得到更多研究者的关注，我国中医药也将会在人类健康领域得到更多突破性的成果。

3 总结

在近 20 年间，冠状病毒新变种不断出现，致病力变强的同时呈现出从局地暴发向全球扩散的特点，给全球健康带来极大威胁。在没有疫苗可用的情况下，抗病毒药物研究对于病毒防控至关重要。令人遗憾的是，目前还没有治疗冠状病毒感染的特效药物被批准上市。通过对现有文献的整理分析可以看出，针对冠状病毒的研究自 2003 年 SARS 疫情出现后才逐渐受到关注，到目前为止 PUBMED 上能检索到 1 万多篇关于冠状病毒的研究论文或综述，其中超过 60% 的文献是围绕 SARS 及 MERS 病毒的生物学特点或防控手段进行的。抗冠状病毒的药物研究多数始于筛选，筛选模型既有病毒感染的细胞模型也有酶水平的生化模型，筛选范围大的可以包括数万个上市药物或已知化合物，小的仅包括定向选择的数个广谱抗病毒化合物，得到的阳性化合物结构类型较多，且更多出现在抗病毒剂或免疫调节剂中。随着人类对于冠状病毒结构和生物学性质的认识不断深入，基于病毒生命周期的全新药物设计逐渐显露，一类是基于在病毒与受体结合以及融合过程中发挥重要作用的刺突蛋白关键结构域，设计靶向病毒进入的单克隆抗体药物和抗病毒融合肽；另一类是基于冠状病毒 3CL 蛋白酶的催化结构域设计靶向病毒复制的拟肽类或小分子蛋白酶抑制剂。这两大类抗病毒化合物具有机制清楚、抗病毒活性强的优势，有些单克隆抗体的抗病毒活性已经在动物模型上得到了验证，因此研究进展相对更深入。但是，单抗药物的研发成本高、肽类药物的药学性质差都是毋庸置疑的问题。因此，肽类药物向小分子抑制剂的优化研究是现在有些团队的研究方向。除此之外，病毒存在抗原漂移和耐药突变的问题，很容易导致疫苗失效和特异性抗病毒药物耐受。宿主靶点具有相对保守和广谱抗病毒的特点，因此，在应对新毒种或未知病毒突发状况时，宿主靶向抗病毒药物可能具有更广阔的应用空间。总之，随着新病毒变种的不断暴发，抗冠状病毒药物研究必将吸引科学家和政府更多的研究投入，首个抗冠状病毒特效药物获批上市值得期待。

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李艳萍，Email：liyanping@imb.pumc.edu.cn

2020-03-23

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.001